雞印第安納株沙門(mén)菌生長(zhǎng)、致病性及藥物敏感性研究（四）
3討論
雞的副傷寒是由除雞白痢、雞傷寒沙門(mén)菌之外的多種血清型沙門(mén)菌感染引起的雞常見(jiàn)細(xì)菌病，病原包括腸炎、鼠傷寒、印第安納等血清型沙門(mén)菌。副傷寒沙門(mén)菌中的絕大部分血清型也可導(dǎo)致人的感染，是對(duì)公共衛(wèi)生安全具有重要意義的人畜共患病原菌。印第安納沙門(mén)菌近年來(lái)在家禽養(yǎng)殖、屠宰加工和銷(xiāo)售等動(dòng)物性食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)均有流行的報(bào)道。本研究從安徽一發(fā)病雞病變組織中分離出1株疑似沙門(mén)菌，進(jìn)一步通過(guò)選擇性培養(yǎng)、16S rRNA測(cè)序和全基因組序列SeqSero 1.2數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定為印第安納沙門(mén)菌。Shen等在安徽雞群中分離到多個(gè)血清型沙門(mén)菌，其中印第安納沙門(mén)菌是雞群中較為常見(jiàn)的流行血清型，并且該血清型沙門(mén)菌的污染可能隨著家禽屠宰加工進(jìn)一步向產(chǎn)業(yè)鏈延伸，已經(jīng)成為我國(guó)畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)中最常見(jiàn)血清型之一，威脅食品和公共衛(wèi)生安全。
菌株致病性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)其毒力的重要指標(biāo)。Wang等對(duì)江蘇分離的印第安納、鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌進(jìn)行了體內(nèi)致病性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)血清型沙門(mén)菌都可引起接毒小鼠的肝臟和腸道出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀和組織病變，其中印第安納沙門(mén)菌的癥狀較輕，其LD50約為105 CFU/mL，致病性低于鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌。本研究采用SPF雛雞攻毒試驗(yàn)評(píng)估分離株對(duì)雞的致病性及其LD50發(fā)現(xiàn)，SM24分離株的LD50為8.50×105 CFU，接種雛雞出現(xiàn)肝臟出血、膽囊充盈，脾臟略腫大、卵黃嚴(yán)重吸收不良等組織病變。研究發(fā)現(xiàn)，菌株毒力基因的攜帶與其致病性密切相關(guān)。通過(guò)全基因組測(cè)序和VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SM24攜帶280個(gè)毒力基因，其中主要為分泌系統(tǒng)、黏附、鐵攝取、免疫逃避等相關(guān)毒力基因。
沙門(mén)菌T3SS是由SPI1和SPI2編碼的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，具有將效應(yīng)蛋白直接注入宿主細(xì)胞的能力，可使細(xì)菌能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的多種反應(yīng)，如細(xì)胞骨架重排、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而增加這些細(xì)菌的致病性。在SM24基因組中涉及分泌系統(tǒng)的基因主要編碼T3SS，分別由35個(gè)SPI1基因和39個(gè)SPI2基因編碼。除此之外，分離株基因組中還包含編碼T6SS的基因，T6SS的存在能介導(dǎo)細(xì)菌與細(xì)菌之間以及細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間的相互作用，使細(xì)菌在競(jìng)爭(zhēng)中獲得生存優(yōu)勢(shì)。
黏附因子是沙門(mén)菌重要的毒力因子，SM24菌株基因組擁有大量的菌毛黏附和運(yùn)動(dòng)侵襲黏附相關(guān)毒力基因。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外黏附試驗(yàn)中，印第安納沙門(mén)菌對(duì)細(xì)胞的黏附性和侵襲性明顯低于鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌，但在黏附后的增殖效率顯著高于其他血清型。鐵攝取能力和免疫逃逸基因是細(xì)菌在宿主體內(nèi)定殖、生長(zhǎng)和逃避免疫的重要致病基礎(chǔ)。
分離株可以編碼多條與鐵攝取和免疫逃逸相關(guān)的基因，此外，SM24基因組中還攜帶多種與入侵、調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)等相關(guān)的毒力基因。本研究表明，分離株SM24對(duì)SPF雛雞具有明顯致病性，并引發(fā)多種組織器官的病理變化，但關(guān)于其毒力基因與禽類(lèi)宿主的致病性及其致病機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
耐藥性表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離株SM24為多重耐藥株，在測(cè)試的23種抗生素中對(duì)16種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，耐藥譜廣，臨床上可選擇用于治療的藥物很少，如不通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選，極易造成治療的失敗。劉海霞等對(duì)廣東省禽產(chǎn)品中印第安納沙門(mén)菌的耐藥情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對(duì)四環(huán)素的耐藥性達(dá)100%，對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢噻肟的耐藥性分別為55.6%和30.6%，97.2%的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。王魯彥等對(duì)人源及動(dòng)物源印第安納沙門(mén)菌的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)多種藥物都呈現(xiàn)耐藥性，且對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、左氧氟沙星、吉米沙星的耐藥率均逐年上升。Gong等發(fā)現(xiàn)印第安納沙門(mén)菌分離株具有較高的耐藥性，尤其是對(duì)四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、葉酸途徑抑制劑、酚類(lèi)、青霉素類(lèi)、單內(nèi)酰胺類(lèi)和硝基呋喃類(lèi)藥物。菌株耐藥基因的攜帶率與菌株的耐藥表型呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。
通過(guò)對(duì)SM24基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該分離株共攜帶144個(gè)與耐藥相關(guān)的編碼基因，其中大部分與多重耐藥性相關(guān)。與本研究的發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，很多研究報(bào)道顯示印第安納沙門(mén)菌基因組中攜帶大量耐藥基因。Yu等在家禽分離的印第安納沙門(mén)菌中鑒定出65個(gè)屬于不同家族的抗性基因，包括編碼與抗生素外排泵、降低β-內(nèi)酰胺滲透性、對(duì)克林霉素產(chǎn)生抗性的突變體、耐磺胺類(lèi)和耐三甲氧芐啶等相關(guān)耐藥基因。
王學(xué)鋒發(fā)現(xiàn)多數(shù)印第安納沙門(mén)菌分離株攜帶blaCTX-M(blaOXA-1、blaTEM-1)、sul1、aacC4、aac(6′)-Ib、floR和dfrA17耐藥基因。一些研究發(fā)現(xiàn)，在從雞或雞肉產(chǎn)品中分離的印第安納沙門(mén)菌的基因組中出現(xiàn)mcr-1基因，在本研究和已報(bào)道的安徽地區(qū)雞源印第安納沙門(mén)菌基因組中尚未發(fā)現(xiàn)mcr-1基因的攜帶。由于mcr-1基因編碼的耐黏菌素基因可導(dǎo)致“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，因此應(yīng)持續(xù)關(guān)注mcr-1基因在沙門(mén)菌中的分子流行動(dòng)態(tài)。
研究表明，印第安納沙門(mén)菌的多重耐藥性與細(xì)菌染色體上的1類(lèi)整合子和IncHI2質(zhì)粒攜帶的多種抗生素耐藥基因密切相關(guān)。本研究中SM24分離株基因組中未發(fā)現(xiàn)1類(lèi)整合子基因，但在其基因組中存在1個(gè)IME位點(diǎn)并攜帶OmpK37耐藥基因。SM24基因組中攜帶的質(zhì)粒類(lèi)型為IncHI2質(zhì)粒，包含IncHI2和IncHI2A兩個(gè)復(fù)制子，并且攜帶11種不同的耐藥基因，由此推斷，該印第安納沙門(mén)菌分離株具有整合和水平轉(zhuǎn)移耐藥基因的能力。細(xì)菌為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化，在遺傳進(jìn)化過(guò)程中會(huì)形成獨(dú)有的基因組特征。
分離株與6株國(guó)內(nèi)雞源印第安納沙門(mén)菌分離株基因組的比較分析表明，除共有基因外，分離株SM24擁有最多的獨(dú)有基因。通過(guò)構(gòu)建的細(xì)菌基因組進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，分離株SM24與國(guó)內(nèi)6株印第安納沙門(mén)菌的遺傳距離均較遠(yuǎn)，表明其可能具有較為獨(dú)特的生理和代謝特征，可為進(jìn)一步研究相關(guān)獨(dú)有基因功能提供基礎(chǔ)素材。
4結(jié)論
從安徽肥東地區(qū)發(fā)病雞病變組織中分離出1株印第安納沙門(mén)菌，該分離株對(duì)雛雞具有致病性，對(duì)16種抗生素表現(xiàn)出明顯耐藥性，耐藥譜廣。進(jìn)一步全基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其基因組攜帶大量毒力和耐藥相關(guān)基因，且具有可轉(zhuǎn)移耐藥基因的IME位點(diǎn)和IncHI2質(zhì)粒。本研究為深入探討印第安納沙門(mén)菌致病和耐藥的分子機(jī)制提供參考。
相關(guān)新聞推薦
1、?刺糖多孢菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定與最佳培養(yǎng)溫度
2、結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性、培養(yǎng)方法及應(yīng)用
3、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒構(gòu)建燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系（一）