滸苔多糖降解微生物采集、分離、篩選、鑒定及生長(zhǎng)曲線測(cè)定（一）
摘要：滸苔中含有大量的滸苔多糖，分解、利用及轉(zhuǎn)化滸苔多糖對(duì)藻類(lèi)資源利用以及海洋碳循環(huán)具有重要意義。為篩選出能降解滸苔多糖的微生物，提高滸苔生物量的回收利用效率，本研究利用微生物分離鑒定以及基質(zhì)測(cè)試技術(shù)從滸苔綠潮中分離鑒定了浮游及滸苔附著微生物，成功地從分離到的菌株中篩選出能降解滸苔多糖的菌株，并選取黃桿菌Algibacter lectus S7和交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6作為代表菌株進(jìn)行碳源利用譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃桿菌Algibacter lectus S7可以分解利用滸苔多糖、木聚糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖；交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6可以分解利用滸苔多糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖和糊精。從生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)，兩菌株均能高效分解利用滸苔多糖，并分別揭示了兩菌株對(duì)碳源利用情況，為海洋微生物對(duì)滸苔多糖的分解代謝研究及工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供菌種資源及碳源參考。
滸苔（Ulva prolifera，Enteromorpha prolifera），隸屬于綠藻門(mén)石莼科滸苔屬，俗稱“海青菜”“綠紫菜”，是生活在近海灘涂中的天然野生綠藻，也是我國(guó)東南沿海最常見(jiàn)的海洋綠藻之一。自2007年起，每年夏季我國(guó)黃海都會(huì)爆發(fā)由滸苔引發(fā)的大規(guī)模綠潮。其中，2008年青島暴發(fā)的滸苔綠潮是世界上最大的綠潮，影響海域超過(guò)2萬(wàn)km2，實(shí)際覆蓋面積超過(guò)400 km2。大量漂浮滸苔遮蔽陽(yáng)光，消耗水中氧氣，造成海洋生物死亡，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及海洋環(huán)境帶來(lái)極大的危害。為減少滸苔綠潮對(duì)海洋環(huán)境的污染，政府每年都要花費(fèi)巨額資金，出動(dòng)大量人力來(lái)打撈滸苔，同時(shí)面臨著提高滸苔生物量資源的回收利用效率問(wèn)題。
滸苔多糖是滸苔生物量的主要成分，占滸苔干重的20%～70%。滸苔多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等多種生理活性功能。而低分子量的滸苔寡糖具有更好的生物活性及水溶性，更廣泛地應(yīng)用于藥物及功能性食物中。同時(shí)，滸苔可作為生產(chǎn)生物柴油及生物乙醇的材料。目前對(duì)滸苔生物量的資源利用還存在成本高、轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題。因此，篩選出能高效降解滸苔多糖的微生物及酶類(lèi)，加快多糖物質(zhì)的降解，是提高滸苔生物質(zhì)利用效率及實(shí)現(xiàn)資源轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，也是滸苔綠潮污染治理中重要的一環(huán)。
滸苔多糖主要成分為葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等，并且含有以糖醛酸和硫酸基為主要結(jié)構(gòu)的水溶性多糖，其中糖醛酸和硫酸根的含量相對(duì)比較穩(wěn)定。目前對(duì)滸苔多糖降解微生物的研究還十分匱乏。Li等從腐爛滸苔綠藻表面底泥中分離到一株γ-變形菌門(mén)的交替單胞菌（Alteromonas sp.A321），發(fā)現(xiàn)它能產(chǎn)生某種可分解滸苔多糖的酶。此外，黃桿菌在滸苔綠潮爆發(fā)時(shí)期大量出現(xiàn)。Liu等分析并比較了膠州灣滸苔綠潮爆發(fā)區(qū)域中不同時(shí)期滸苔附著微生物及海水中微生物的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)滸苔綠潮中期的海水中黃桿菌的豐度最高，達(dá)45%。另?yè)?jù)Lin等研究發(fā)現(xiàn)，爆發(fā)滸苔的養(yǎng)殖水體中黃桿菌豐度是沒(méi)有爆發(fā)滸苔的水體中的3～5倍。黃桿菌的大量出現(xiàn)可能是由于黃桿菌能首先分解利用滸苔多糖，因而在與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)碳源時(shí)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，得以大量生長(zhǎng)繁殖。
本研究對(duì)滸苔綠潮期間的微生物進(jìn)行了分離及鑒定，篩選出了能降解滸苔多糖的微生物，并選取2株代表菌進(jìn)行了多糖底物利用譜分析。以期能篩選出高效降解滸苔多糖的微生物，并解析其多糖底物利用譜，為由滸苔引起的海洋污染的治理問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)和菌種資源；為工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供新思路。
1材料與方法
1.1滸苔及微生物樣品的采集及分離鑒定
在廣西北海金海灣紅樹(shù)林海域和山東青島棧橋及金沙灘海域的滸苔綠潮爆發(fā)地用無(wú)菌自封袋和采樣瓶分別采集滸苔及海水樣品。分別分離滸苔附著微生物和海水中的浮游微生物。
滸苔附著微生物的分離方法：取50 g新鮮滸苔用500 mL無(wú)菌海水清洗3遍后瀝干，裝入1 000 mL無(wú)菌錐形瓶中，加入500 mL無(wú)菌海水，置于超聲清洗機(jī)中超聲水浴（35 kHz）并用振蕩的方法分離，收集液體。
分別取海水及滸苔附著菌液，梯度稀釋后均勻涂布于2216E固體海洋培養(yǎng)基平板上，倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取單菌落，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，放入28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。用16S rRNA通用引物對(duì)27F/1492R PCR擴(kuò)增后送測(cè)序公司測(cè)序，通過(guò)比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定微生物的種類(lèi)，并將分離鑒定后的菌株用20%甘油保存于-80℃冰箱中。
選取重點(diǎn)分析的5個(gè)菌株，分別根據(jù)NCBI中序列的比對(duì)結(jié)果，選取相似度高的幾株菌的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在Mega X中用Clustal W對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)后用鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
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