呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌生長曲線、細(xì)胞壁的影響及抑制效果——結(jié)果
2結(jié)果
2.1呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌的抑菌效果
如表1所示，雞肺源大腸桿菌對(duì)中藥復(fù)方呼寧散為中度敏感，表明其有一定的抑菌效果。MIC和MBC結(jié)果如圖1，隨著呼寧散濃度升高，混合液的顏色逐漸變淺，當(dāng)呼寧散濃度為250 mg·mL-1時(shí)，紅色沉淀完全消失，混合液變得澄清，測(cè)得呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌的MIC為250 mg·mL-1，MBC為500 mg·mL-1。
表1藥敏試驗(yàn)結(jié)果(xˉ±s)
圖1呼寧散(HNP)對(duì)雞肺源大腸桿菌的MIC和MBC
2.2呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌生長曲線的影響
由圖2可知，空白組的細(xì)菌生長繁殖較快，10 h之后細(xì)菌的生長達(dá)到較平穩(wěn)狀態(tài)。與空白組相比，呼寧散MIC組和1/2 MIC組作用雞肺源大腸桿菌24 h內(nèi)，細(xì)菌生長均受到明顯抑制(P<0.01)。結(jié)果表明，呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌的生長具有明顯的抑制作用。
圖2雞肺源大腸桿菌的生長曲線
2.3呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌細(xì)胞壁的影響
如圖3所示，與空白組相比，呼寧散作用6和12 h時(shí)，1/2 MIC組和MIC組培養(yǎng)液中AKP活性均極顯著升高(P＜0.01)，表明呼寧散能夠?qū)﹄u肺源大腸桿菌的細(xì)胞壁造成破壞。
圖3雞肺源大腸桿菌中AKP活性檢測(cè)結(jié)果
2.4呼寧散對(duì)雞肺源大腸桿菌細(xì)胞膜的影響
如圖4所示，空白組菌液中的可溶性蛋白含量和核酸含量基本穩(wěn)定在較低水平，無明顯波動(dòng)。與空白組相比，呼寧散作用6和12 h時(shí)，1/2 MIC組和MIC組培養(yǎng)液中的可溶性蛋白含量和核酸含量極顯著增加(P＜0.01)。表明呼寧散能夠?qū)﹄u肺源大腸桿菌的細(xì)胞膜造成破壞，導(dǎo)致胞外蛋白濃度升高、核酸外溢。
圖4雞肺源大腸桿菌中可溶性蛋白和核酸含量檢測(cè)結(jié)果
2.5 LPS對(duì)DF-1細(xì)胞的最低染毒劑量
CCK-8結(jié)果如圖5所示，當(dāng)LPS濃度在40μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)。因此，本試驗(yàn)選擇40μg·mL-1作為LPS誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞損傷模型的染毒劑量。
圖5 LPS對(duì)DF-1細(xì)胞活力的影響
2.6呼寧散對(duì)DF-1細(xì)胞的安全給藥濃度
CCK-8結(jié)果如圖6所示，在1.5~2.5 mg·mL-1呼寧散作用下，細(xì)胞存活率為80%~95%，且無明顯差異性，呼寧散在3 mg·mL-1濃度下細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，在4 mg·mL-1呼寧散作用下細(xì)胞成活率極顯著降低(P<0.01)，說明呼寧散在1~2.5 mg·mL-1濃度對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用，因此本試驗(yàn)選用1.5、2、2.5 mg·mL-1作為呼寧散低、中、高劑量組的給藥濃度。
圖6呼寧散(HNP)對(duì)DF-1細(xì)胞活力的影響
2.7呼寧散對(duì)LPS致DF-1細(xì)胞炎癥因子含量的影響
收集各試驗(yàn)組細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8的含量。結(jié)果如表2所示，與空白組相比，LPS組中IL-1β、IL-8含量均極顯著升高(P<0.01)，IL-6含量顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，呼寧散低劑量組IL-6、IL-8的含量降低但無顯著性差異(P>0.05)，IL-1β的含量極顯著降低(P<0.01)；呼寧散中劑量組IL-1β的含量極顯著降低(P<0.01)，IL-6含量顯著降低(P<0.05)，IL-8的含量降低但無顯著性差異(P>0.05)；呼寧散高劑量組IL-1β、IL-6含量均極顯著降低(P<0.01)，IL-8的含量顯著降低(P<0.05)。表明呼寧散可抑制LPS所致DF-1細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的過度分泌。
表2 DF-1細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量(xˉ±s)
2.8呼寧散對(duì)LPS致DF-1細(xì)胞TLR4/NF-κB炎性通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響
Western blot法測(cè)定TLR4和細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)，如圖7所示，與空白組相比，LPS組TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。與LPS組相比，呼寧散低、中、高劑量組TLR4表達(dá)極顯著降低(P<0.01)；呼寧散中劑量組NF-κB p65蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，呼寧散低、高劑量組NF-κB p65蛋白表達(dá)量降低但無顯著性差異(P>0.05)。表明呼寧散可通過調(diào)控LPS所致DF-1細(xì)胞內(nèi)炎性通路關(guān)鍵蛋白TLR4和NF-κB p65的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗炎能力。
圖7 DF-1細(xì)胞TLR4炎癥通路關(guān)鍵蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果
2.9呼寧散對(duì)LPS致DF-1細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)及抗氧化物的影響
通過試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA及抗氧化物SOD活性、GSH含量。ROS結(jié)果如圖8所示，與空白組相比，LPS組含量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，呼寧散低、中、高劑量組ROS含量均極顯著降低(P<0.01)。MDA、SOD、GSH結(jié)果如表3所示，與空白組相比，LPS組MDA含量極顯著升高(P<0.01)，SOD活性極顯著降低(P<0.01)，GSH含量顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，呼寧散低劑量組MDA含量顯著降低(P<0.05)，呼寧散中高劑量MDA含量極顯著下降(P<0.01)；呼寧散低劑量組細(xì)胞SOD活性極顯著升高(P<0.01)，GSH含量升高但無顯著性差異(P>0.05)，而呼寧散中、高劑量組細(xì)胞SOD活性及GSH含量均極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，呼寧散可降低LPS損傷的DF-1細(xì)胞模型內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的含量并增強(qiáng)抗氧化物的含量，緩解LPS所致的細(xì)胞氧化損傷。
A.氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果；B.氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS平均熒光強(qiáng)度；a.空白組(Normal)；b.LPS組；c.呼寧散低劑量組(HNP1.5)；d.呼寧散中劑量組(HNP2)；e.呼寧散高劑量組(HNP2.5)
圖8 DF-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平
表3 DF-1細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、GSH含量(xˉ±s)
2.10呼寧散對(duì)LPS致DF-1細(xì)胞Keap1/Nrf2氧化通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響
Western blot法測(cè)定Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1的表達(dá)量，結(jié)果如圖9所示，與空白組相比，LPS組Keap1極顯著升高(P<0.01)，Nrf2、NQO1極顯著降低(P<0.01)，HO-1顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，呼寧散低劑量組Keap1降低但無顯著性差異(P>0.05)，Nrf2、NQO1、HO-1顯著升高(P<0.05)；呼寧散中、高劑量組Keap1極顯著降低(P<0.01)，Nrf2、NQO1極顯著升高(P<0.01)，HO-1升高但無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，呼寧散可以通過調(diào)控LPS所致DF-1細(xì)胞內(nèi)Keap1/Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。
圖9 DF-1細(xì)胞Keap1/Nrf2氧化通路關(guān)鍵蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果
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