黑曲霉分生孢子在不同成熟階段的復(fù)雜性和異質(zhì)性研究
研究背景：黑曲霉是一種廣泛存在的真菌，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和生存能力。它們的分生孢子是其無(wú)性繁殖的主要結(jié)構(gòu)，這些孢子在空氣中非常豐富，對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)都有重要影響。黑曲霉的分生孢子形成過(guò)程包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后，特殊的氣生菌絲分化為分生孢子載體，這些載體延伸到空氣中并形成孢子鏈。盡管黑曲霉的分生孢子在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，但其成熟過(guò)程中的特性變化尚不清楚。本研究探討了這些無(wú)性生殖結(jié)構(gòu)上分生孢子的成熟過(guò)程。在分生孢子載體上發(fā)育了2天、5天和8天的色素化分生孢子對(duì)熱的耐受性相似，并且通過(guò)二氧化碳釋放和代謝探針Tempone的轉(zhuǎn)化顯示出代謝活性。當(dāng)2天的分生孢子與5天和8天的孢子相比較時(shí)，有645-2421個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了2倍的變化。與較老的孢子相比，2天的分生孢子的細(xì)胞壁中更容易提取黑色素。此外，2天的分生孢子的甘露醇含量和萌發(fā)率更高。8天的分生孢子通過(guò)水分散的效率較低，但在風(fēng)和疏水移動(dòng)物體的分散方面沒有觀察到差異。這些數(shù)據(jù)以及在實(shí)驗(yàn)中只有少數(shù)分生孢子被分散的事實(shí)表明，黑曲霉的一個(gè)菌落釋放出的分生孢子是異質(zhì)性的。這種異質(zhì)性在環(huán)境條件迅速變化的環(huán)境中（例如水的可用性）會(huì)提供選擇性優(yōu)勢(shì)。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
將10?個(gè)分生孢子稀釋至5×10?個(gè)孢子/毫升的濃度，接種于含有25 mM麥芽糖的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（TM）中。掃描區(qū)域長(zhǎng)度設(shè)置為2205微米，掃描區(qū)域大小設(shè)置為70-700像素，最大物體數(shù)量設(shè)置為1000。從接種后2小時(shí)開始掃描，每小時(shí)掃描一次，直到微菌落開始覆蓋休眠或萌發(fā)的孢子。oCelloScope能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)黑曲霉分生孢子的萌發(fā)過(guò)程，包括孢子的膨脹、萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。通過(guò)分析孢子的表面積和圓度變化，oCelloScope可以將孢子精確分類為休眠孢子、腫脹孢子、萌發(fā)孢子和菌絲，從而提供詳細(xì)的萌發(fā)動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)。提供了孢子萌發(fā)的動(dòng)態(tài)圖像，還生成了詳細(xì)的數(shù)值數(shù)據(jù)，包括孢子的表面積、圓度等參數(shù)，為研究孢子萌發(fā)機(jī)制提供了豐富的信息。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了黑曲霉（Aspergillus niger）分生孢子在分生孢子載體上的成熟過(guò)程，揭示了分生孢子在不同成熟階段的特性變化及其生態(tài)意義。通過(guò)比較2天、5天和8天的分生孢子，發(fā)現(xiàn)有645-2421個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了2倍以上的改變。其中，許多上調(diào)基因的功能未知，而下調(diào)基因多與代謝和生物合成過(guò)程相關(guān)。所有測(cè)試的分生孢子都顯示出代謝活性，通過(guò)PDT的電子自旋共振（ESR）信號(hào)強(qiáng)度降低和CO2釋放來(lái)證實(shí)。2天的分生孢子更容易提取黑色素，而甘露醇含量和萌發(fā)率在2天的分生孢子中更高。8天的分生孢子通過(guò)水分散的效率較低，但在風(fēng)和昆蟲傳播方面沒有觀察到差異。2天的分生孢子萌發(fā)速度更快，而5天和8天的分生孢子萌發(fā)速度較慢。熱處理（55°C，5分鐘）減緩了所有分生孢子的萌發(fā)速度，但沒有觀察到不同成熟階段的分生孢子在熱抗性上的差異。
圖1、黑曲霉2日齡、5日齡和8日齡分生孢子中海藻糖（淺灰色陰影）、甘露醇（深灰色陰影）和甘油（黑色陰影）的量（pg分生孢子）。誤差線表示技術(shù)和生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差
圖2、用鹽水吐溫（深灰色陰影）和NaOH（淺灰色陰影）提取的2日齡、5日齡和8日齡的黑曲霉分生孢子的黑色素量（A）以及2-（管2）、5-（管3）和8日齡（管4）分生孢子的色素沉著用水和NaOH提取后，未提取的2日齡分生孢子作為對(duì)照（管1）（B）。（C）顯示了管2和4提取的孢子顆粒的放大倍數(shù)。對(duì)比度和亮度也同樣增加。誤差線表示生物重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖3、PDT的減少表明黑曲霉2、5和8日齡分生孢子的代謝活性。（A）在分生孢子存在下，t=0（上層）和t=30 min（下層）時(shí)1 mM PDT的ESR譜圖。高場(chǎng)（右）線（H）的高度用于量化PDT。（B）Hheight在2日齡（正方形）、5日（圓）和8（三角形）分生孢子中的減少。使用熱滅活2日齡的分生孢子作為對(duì)照（三角形O）。誤差線代表生物重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差，r.u.是相對(duì)單位。
圖4、在2-（A）、5（B）和8-（C）日齡生物重復(fù)分生孢子的情況下，表明代謝活性的CO2水平增加，通過(guò)CO2傳感器電壓（mV）的降低進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
圖5、在培養(yǎng)基中孵育2-6小時(shí)后，2-（A）、5-（B）和8-（C）日齡孢子的大小分布。條形代表靜止分生孢子（21-42升，無(wú)陰影條）、腫脹的分生孢子（42-76升，淺灰色條）、發(fā)芽分生孢子（76-106升深灰色條）和菌絲生長(zhǎng)（106-212升，黑色條）。由2日齡分生孢子（條紋線）、5日齡（虛線）和8日齡分生孢子產(chǎn)生的所有物體的平均大小（D）。
總結(jié)
本論文主要就黑曲霉（Aspergillus niger）分生孢子在分生孢子載體上的成熟過(guò)程進(jìn)行研究，旨在揭示分生孢子在不同成熟階段的特性變化及其生態(tài)意義。黑曲霉是一種廣泛分布的真菌，其分生孢子在空氣中極為豐富，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康具有重要影響。研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，探討了分生孢子在基因表達(dá)、代謝活性、細(xì)胞壁成分、水分分散效率和萌發(fā)率等方面的變化。oCelloScope在本研究中發(fā)揮了重要的作用，oCelloScope能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)黑曲霉分生孢子的萌發(fā)過(guò)程，包括孢子的膨脹、萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，它不僅提高了孢子萌發(fā)監(jiān)測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，還為研究孢子萌發(fā)機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)支持。研究通過(guò)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)和分析，揭示了黑曲霉分生孢子成熟過(guò)程中的復(fù)雜性和異質(zhì)性，為理解這種真菌的生態(tài)適應(yīng)性和生存策略提供了新的視角。同時(shí)，研究結(jié)果也為進(jìn)一步探索黑曲霉的基因調(diào)控和代謝機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
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