pPopctrl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌top10F生長與突變規(guī)律
基于群體感應的自殺基因回路能賦予宿主菌在一定密度時啟動自殺的特性。在連續(xù)培養(yǎng)條件下可以形成菌群密度的周期振蕩。這樣的振蕩作為基因組件，在合成生物學上有重要用途。美國杜克大學的You等建立起了自殺菌群模型并對其振蕩規(guī)律進行了初步的研究，其建立的基因回路反映在質(zhì)粒pPopctrl上，如圖1所示。
以pPopctrl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌top10F’為研究對象，以不同濃度的IPTG誘導，觀察宿主菌的生長和自殺特征以及在自殺過程中突變菌產(chǎn)生的規(guī)律，并通過基因測序確定變異位點。結(jié)果將為抑制突變個體產(chǎn)生，構(gòu)建更具魯棒性(Robustness)的自殺基因回路提供思路。
1材料與方法
1.1質(zhì)粒、菌株和試劑
質(zhì)粒pPopctrl由美國Duke大學Lingchong You博士惠贈。宿主大腸桿菌Top10F’菌株由本實驗室保藏。按照上海捷瑞生物技術(shù)有限公司的一步法質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試劑盒說明操作，構(gòu)建工程菌(此菌株即為本文所說的野生型菌株wild type)。
試劑：胰蛋白胨購自美國BD公司；MOPS(Free acid 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸，BBI)、硫酸鎂、氯化鈉、IPTG、Kanamycin、LB培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、礦物油、瓊脂糖、溴化乙錠均購自上海生工生物工程有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒(離心柱型)購自上海捷瑞公司，質(zhì)粒全測序和測序引物合成委托上海邁浦生物科技有限公司。
1.2細菌擴大培養(yǎng)
從甘油凍存管中刮取含有pPopctrl質(zhì)粒的top10F’菌株，接種于LB(含50μg/mL的Kanamycin)培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，倍比稀釋后涂布LB平板，37℃溫育24 h，用接種環(huán)挑取單菌落接種于5 mL LB(含50μg/mL的Kanamycin)培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)15 h，作為實驗接種液。
1.3細菌的生長特征監(jiān)測和生長-自殺曲線的繪制
細菌的自殺實驗在TBK培養(yǎng)基中進行。TBK培養(yǎng)基組成為：10 g/L胰蛋白胨(BD公司)、7 g/L氯化鉀、20.93 g/L MOPS緩沖鹽，用5 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，滅菌后備用。將9μL接種液分別接種于9 mL TBK培養(yǎng)基(含50μg/mL的Kanamycin)中，培養(yǎng)基中IPTG濃度分別為0.01、0.05、0.08、0.1、1 mmol/L，并以不加IPTG的培養(yǎng)基作為對照。30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔1.5～2 h取樣200μL于96孔板中先后測定OD600和CFU，繪制生長-時間曲線。
OD600測定使用Perkin-Elmer Multi-label Plate Reader V3。
1.4突變菌株的篩選和鑒別
為了鑒別不同時間點樣品中的野生型和突變型，利用二者生長曲線的不同加以區(qū)分。具體做法是：培養(yǎng)過程中不同時間點取樣，倍比稀釋涂布90 mm LB平板，培養(yǎng)后從中隨機挑取30個單菌落，接種于96孔板中，每孔中加200μL TBK培養(yǎng)基，其中含Kanamycin和1 mmol/L IPTG，接種后每孔再加50μL礦物油封頂以防蒸發(fā)。預留2孔，其中TBK分別含或不含IPTG，此2孔接種野生型菌株分別作為陽性、陰性對照。將該96孔板置于Plate Reader V3中30℃孵育，每隔10 min振板30 s并測定OD600，連續(xù)測定18 h以上。繪制30個孔中30個單菌落的OD-時間生長曲線，與對照孔相比較，確定其中野生型和突變型的數(shù)量。
1.5突變菌株的質(zhì)粒提取和測序
為了研究突變發(fā)生的位點，在不同時間點和不同IPTG濃度的菌液樣品中隨機挑選6株突變菌，LB擴大培養(yǎng)后用試劑盒抽提質(zhì)粒，電泳檢測后送上海邁浦生物技術(shù)有限公司測定質(zhì)粒全長序列。測序結(jié)果用Vector NTI軟件與pPopctrl質(zhì)粒原始序列比對。
1.6突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不含任何質(zhì)粒的top10F’菌株后的生長曲線測定
為了研究是否質(zhì)粒上的突變足以使宿主逃脫群體感應自殺行為，文中選擇將2個已被證實的并已測序的突變質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到不含任何質(zhì)粒的野生型top10F’宿主菌中去，構(gòu)建只有質(zhì)粒突變的準野生型細菌，按照1.3中的方法測定CFU生長曲線。
2結(jié)果與分析
2.1不同IPTG條件下野生型的生長曲線和自殺強度
含有pPopctrl自殺質(zhì)粒的top10F’細菌在含有不同濃度IPTG的培養(yǎng)基中的生長曲線如圖2、3所示。從OD600曲線(圖2)可見，IPTG的濃度對菌群密度有十分明顯的影響，特別是在12 h以后，添加IPTG的樣品管中濁度呈現(xiàn)顯著差異。但是由于CcdB蛋白的細胞毒性體現(xiàn)在抑制了DNA復制，而細胞并不裂解，因此CFU曲線(圖3)比OD600曲線更能準確地反映菌群的生長特征。從圖3可以看出，6 h以前，各管細菌正常生長，而6 h以后，細菌開始大量自殺，CFU值迅速下降，在12 h前后降至最低值，而細菌的自殺率與IPTG濃度呈正相關(guān)。當IPTG濃度為1 mmol/L時，在短短6 h時間里，99.8%的細菌死亡，而IPTG濃度為0.05 mmol/L時，這一數(shù)值為98%，對于IPTG為0.01 mmol/L的樣品管，其菌群密度一直低于對照管，但在整個實驗周期內(nèi)，觀察不到明顯的自殺現(xiàn)象。在12 h以后，菌群密度逐步緩慢回升，但在15 h后，由于營養(yǎng)條件的限制，菌群密度趨于穩(wěn)定。
圖2野生型細菌在不同IPTG濃度TBK培養(yǎng)基中的生長曲線(OD600曲線)
圖3野生型細菌在不同IPTG濃度TBK培養(yǎng)基中的生長曲線(CFU曲線)
圖3還顯示細菌開始自殺的時間與IPTG濃度無關(guān)。在本文的實驗條件下，群體感應發(fā)生作用或者說AHL分子達到閾值所需的菌群密度約為5×107個/mL。
上述現(xiàn)象可以根據(jù)自殺基因回路的設計原理得到合理的解釋。IPTG濃度越大，lac啟動子被誘導生成的R蛋白越多，AHL分子達到閾值后，被激活的R*也就越多，從而使lux啟動子被更頻繁地啟動，大量的CcdB蛋白引起細菌自殺。而AHL濃度的累積僅僅與菌群密度有關(guān)，在其濃度達閾值前，所有樣品管中的細菌生長速率相同，因此在同一時刻啟動自殺。
2.2突變菌株的篩選和自殺過程中突變種群的蔓延
按照1.4中的方法，在每一個時間點取樣涂布平板后隨機挑選30個單菌落接種96孔板，繪制生長曲線并與陰性(Wild type,no IPTG)、陽性(Wild type with 1 mmol/L IPTG)對照比較。以0.1 mmol/L IPTG管13.5 h的樣品為例，曲線如圖4所示。
圖5不同IPTG條件下突變型個體隨時間產(chǎn)生和蔓延的趨勢
隨機挑選的30個單菌落中，有15個的生長曲線與陰性對照即不加IPTG的野生型一致，說明這些菌株不再被IPTG誘導自殺，屬于突變型個體，因此確定在IPTG濃度0.1 mmol/L的樣品管13.5 h的菌液中突變型比例為50%。
按照這一方法，我們研究了突變型個體隨時間產(chǎn)生并逐漸蔓延的趨勢(圖4)。
從圖3可知，6 h時細菌已經(jīng)開始自殺；而通過圖5可見，對于1、0.1、0.08 mmol/L IPTG的3個試管，突變型個體在9 h時才被篩選出來；而對于0.05 mmol/L的試管，則到12 h才有突變型出現(xiàn)。突變型個體的蔓延也與IPTG濃度密切相關(guān)。IPTG濃度越大，突變型個體蔓延得越快，伴隨著野生型個體的大量自殺，突變型將迅速統(tǒng)治整個種群。
這一結(jié)果暗示：如果采用連續(xù)培養(yǎng)模式，利用6～9 h之間的窗口期，就有可能實現(xiàn)菌群密度的連續(xù)振蕩而不被突變型個體所破壞。另一方面，如果將以IPTG濃度為參數(shù)的選擇壓力控制在一個合適水平，有可能實現(xiàn)野生型和突變型和平共存的穩(wěn)態(tài)群落結(jié)構(gòu)。
結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)與細菌生死存亡相關(guān)的選擇壓力越大，亦即對細菌的殺傷力越大，突變型個體產(chǎn)生得越早蔓延得也越迅速。這方面的深入研究對總結(jié)殺菌型藥物的給藥劑量和頻率有啟示作用。
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