基于超微藥粉瓊脂稀釋法檢測(cè)9種致病菌對(duì)常用15種中藥的敏感性（二）
2.2紙片法測(cè)定中藥水提液對(duì)致病菌的抑菌圈大小
選取致病菌敏感性不同的3種中藥（五倍子、地榆、石榴皮），按照中藥高壓水提液的制備方法制備藥敏實(shí)驗(yàn)的藥液，然后依據(jù)紙片法測(cè)定此3種藥液對(duì)4株鰻鱺致病菌的抑菌圈大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中數(shù)據(jù)可知，不同濃度藥液對(duì)4株鰻鱺致病菌的抑菌圈大小各不相同，隨濃度的升高呈增大趨勢(shì)。B01對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子125 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮500 mg/l；B09對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子500 mg/l、地榆500 mg/l、石榴皮500 mg/l；B14對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子250 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l；B15對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子250 mg/l、地榆250 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l。由此說(shuō)明4株致病菌對(duì)五倍子均表現(xiàn)為高度敏感，B09、B15對(duì)地榆及B01、B09對(duì)石榴皮表現(xiàn)為高度敏感，B01、B14對(duì)地榆及B15對(duì)石榴皮顯示為中度敏感，而B(niǎo)14對(duì)石榴皮表現(xiàn)為不敏感。
2.3平板二倍稀釋法測(cè)定中藥水提液對(duì)致病菌的抑菌效果
表2紙片法檢測(cè)4株鰻鱺致病菌對(duì)3種中藥水提液的敏感度（平均抑菌圈直徑mm）
選取致病菌較敏感的8種中藥（見(jiàn)表3），采用平板二倍稀釋法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。從表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：平板二倍稀釋法測(cè)定8種中藥抑制9株致病菌的平均MIC值比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)定的結(jié)果均偏高，即靈敏度下降，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總體趨勢(shì)相一致。
9株致病菌對(duì)五倍子仍然均呈現(xiàn)出高度敏感；對(duì)首烏藤除B19、B20為中度敏感外，其余7株菌均表現(xiàn)為高度敏感；對(duì)地榆高度敏感的菌株是B09、B15、B18、B20，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果少一株B19，降為中度敏感；對(duì)石榴皮低敏感和不敏感的菌株是B10、B14、B15、B18、B20，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果多了三株（B15、B18、B20）；對(duì)貫眾低敏感和不敏感的菌株是B09、B14、B15、B20、B27，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果多了二株（B14、B15）；對(duì)大黃中度敏感的菌株是B01、B15，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果少了一株B10；對(duì)黃芩除了B01、B19表現(xiàn)低度敏感外，其余均為不敏感；對(duì)虎杖高度敏感的菌株是B01、B18，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果少了二株（B10、B14），降為中度敏感。
3討論
本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有選擇試管二倍稀釋法測(cè)定致病菌對(duì)中藥的敏感度，是因?yàn)橹兴幋痔嵋汉写罅可兀伾睿也煌兴幩幰旱念伾鞑幌嗤瑫?huì)影響最終結(jié)果的觀察判斷，故在初期篩選抗菌中藥的研究中不宜采用試管二倍稀釋法。因此，我們選擇藥敏紙片法和平板二倍稀釋法篩選抗菌中藥，測(cè)定中藥藥液的抑菌效果，與本文建立的超微藥粉瓊脂稀釋法進(jìn)行比較，以確定該方法的可行性和可靠性。
表3平板二倍稀釋法測(cè)定各種中藥水提液的最低抑菌濃度MIC（mg/l）
3.1藥敏紙片法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較
針對(duì)9株致病菌從15種中藥篩選出具有高效抑菌作用的藥材。采用藥敏紙片法一次試驗(yàn)需要制備81個(gè)瓊脂平板；而采用超微藥粉瓊脂稀釋法一次試驗(yàn)只需要45個(gè)瓊脂平板。兩者相比，篩選工作量顯著減少，操作更快捷，實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)大大降低。
前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于受紙片上藥物含量的限制，低敏感度和不敏感的中藥對(duì)致病菌均不產(chǎn)生抑菌圈，且考慮到實(shí)驗(yàn)操作量，故表2中只選擇抑菌效果較好的3種中藥（五倍子、地榆、石榴皮）和有代表性的4株致病菌進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。從表1和表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得有效抑菌濃度低于紙片法，即靈敏度相應(yīng)提高，然而4株致病菌對(duì)中藥五倍子、地榆、石榴皮的分級(jí)敏感程度與紙片法檢測(cè)結(jié)果一致。
3.2平板二倍稀釋法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較
平板二倍稀釋法與紙片法所使用的藥物都是液體，在做藥敏實(shí)驗(yàn)之前同樣都要通過(guò)耗時(shí)較長(zhǎng)、操作較復(fù)雜的中藥提取工序。而超微藥粉瓊脂稀釋法，只需將中藥藥材進(jìn)行超微粉碎處理即可，步驟簡(jiǎn)單。由于藥材粉碎顆粒足夠細(xì)，達(dá)到了5～10μm，保證藥材中的有效成分在瓊脂培養(yǎng)基中可以充分溶出，無(wú)需再考慮有效成分提取率高低對(duì)藥敏結(jié)果的負(fù)面影響。
比較表1和表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，9株致病菌對(duì)8種不同中藥的敏感度顯示，超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得平均最低抑菌濃度均低于平板二倍稀釋法，靈敏度明顯增加。雖然這兩種方法在抑菌濃度上測(cè)得數(shù)據(jù)有差異，個(gè)別菌株的敏感度級(jí)別發(fā)生變化，但不同中藥對(duì)某一株致病菌的抑制效應(yīng)強(qiáng)弱是一致的。
超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)定的中藥MIC值均低于平板二倍稀釋法，原因在于平板二倍稀釋法使用的是中藥超微粉的高壓水提液，而超微藥粉瓊脂稀釋法是直接使用中藥超微粉；采用水煎煮、高壓抽提、超聲提取、微波提取或有機(jī)溶劑萃取等中藥粗提方法，均無(wú)法將中藥植物藥材細(xì)胞內(nèi)的有效成分完全溶出，且提取過(guò)程也會(huì)造成有效成分的部分降解失活，故降低了抑菌效果；而本法將中藥超微粉直接添加入瓊脂培養(yǎng)基，在進(jìn)行抑菌藥敏實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，微米級(jí)顆粒的藥粉一直存在于細(xì)菌培養(yǎng)基內(nèi)，不斷釋放抗菌有效成分，可達(dá)到較高的抑菌濃度。故可避免由于中藥粗提方法選擇不當(dāng)，造成有效物質(zhì)提取率低，而容易在初步篩選時(shí)將高效的抗菌藥材遺漏等問(wèn)題。
綜上所述，本文建立的抗菌中藥植物藥材的初步篩選方法——超微藥粉瓊脂稀釋法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、耗時(shí)短、處理量大（即每一個(gè)90 mm平皿可同時(shí)檢測(cè)9～12株致病菌對(duì)藥物的敏感度），實(shí)驗(yàn)成本低，以及藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效率的藥敏實(shí)驗(yàn)方法，在實(shí)驗(yàn)研究中具有很好的應(yīng)用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)和應(yīng)用植物中藥提供基礎(chǔ)的參考數(shù)據(jù)。
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