基于刃天青微量板法檢測沙門氏菌抗生素的耐藥性（一）
摘要采用刃天青微量板法檢測多株沙門氏菌對抗生素的耐藥性，得到最小抑菌濃度（MIC）。通過肉眼觀察和熒光檢測都可判定沙門氏菌的耐藥性，判定時間僅需5 h，刃天青法與微量肉湯稀釋法檢測得到的耐藥性結果一致。其中用顏色觀察能更清晰明確地分辨出耐藥折點，熒光檢測可以動態地反映細菌隨時間變化的生長情況。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏度高的特點，能確定抗生素的耐藥性和精確耐藥MIC值。
沙門氏菌（Salmonella）作為一種食源性病原體，對人類健康構成了巨大威脅。沙門氏菌可通過受污染的畜禽產品、蛋、奶乃至海洋產品感染人類。近年來，由于抗生素的廣泛使用，出現了沙門氏菌耐藥株和多重耐藥株，導致沙門氏菌耐藥性問題日益嚴重，對畜牧業和人類健康都構成了潛在威脅。
為了應對這種威脅，迫切需要進行抗生素敏感測試（AST），以快速診斷這些危險細菌的耐藥性，確保快速、準確地使用抗生素。當前，各種傳統實驗室方法可用來表征微生物對抗生素的體外敏感性，如常量肉湯稀釋和微量肉湯稀釋法、圓盤擴散法和抗菌梯度法等。但是，這些方法多數都需要冗長的測試程序，通常需要經歷收集樣品、富集培養物，在這之后還至少需要孵育16 h才能進行檢測。耐藥細菌的流行率增加表明現在迫切需要能夠在數小時而不是數天之內提供藥敏性數據的AST。除了常規檢測方法，mPCR法和全自動微生物分析儀測定法等新型檢測技術也已運用在耐藥性檢測中。基于已知和賦予細菌抗性基因的擴增和檢測技術，與常規培養方法相比，酶促擴增技術減少了檢測時間。但這些技術需要大型且昂貴的儀器，這限制了它們在資源受限的環境中的使用。
刃天青（resazurin）作為一種氧化還原染料，活細菌可以將刃天青轉化為粉紅色的熒光染料試鹵靈（resorufin），繼續反應可以變為白色無熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）。因其安全無毒、經濟實惠的優點，已被越來越多地應用于細胞活力和細胞增殖能力的評估。以刃天青為指示劑的低成本藥敏試驗方法，能動態地反映細菌的生長情況，可以檢測藥物的作用時間和細菌的耐藥情況。該研究采用刃天青法檢測沙門氏菌對幾種抗生素的敏感性，確定最佳試驗條件，為沙門氏菌的快速、簡便檢測提供一種新方法。
1材料與方法
1.1試材
氧氟沙星（Ofloxacin）、環丙沙星（Ciprofloxacin）購自上海麥克林生化科技有限公司;氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）購自美國Sigma試劑有限公司;氨芐西林（Ampicillin）、美羅培南（Meropenem）、四環素（Tetracycline）、刃天青（Resazurin）、鹽酸（HCl）購自上海國藥集團;營養肉湯（NB）、營養瓊脂（NA）購自上海博威生物醫藥有限公司。所有溶液均用超純水制備，所有試劑均為分析純。鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（Salmonella typhimurium）為實驗室保存菌株，其余沙門氏菌（Salmonella）分離株均來自華中農業大學，-80℃保存備用。
1.2儀器
Lab Dancer漩渦儀，IKA公司;Spectra MAX M5酶標儀，美國Molecular Devices;WGZ-XT細菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司;平底96孔細菌培養板， 丹麥Biosense公司;VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC;BSC-1300超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;SHP-150生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司;EX-OHOUS電子天平，美國奧豪斯公司;Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。
1.3細菌培養
取沙門氏菌接種于NB培養基，在37℃搖床培養，通過細菌濁度儀檢測細菌濃度。將濃度為0.5 MCF的菌液進行梯度稀釋，取100μL涂布NA瓊脂平板，37℃培養24 h，進行菌落計數，計算出0.5 MCF菌液對應的細菌培養物的菌落數及菌落形成單位（CFU/mL）。最后用NB將菌液稀釋成所需濃度，4℃冰箱保存備用。
1.4微量肉湯稀釋法藥敏試驗
按美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）方案，將倍比稀釋的不同濃度的抗生素分別加到無菌的96孔培養板中，1～11孔加入系列稀釋抗生素100μL，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。將培養的沙門氏菌菌懸液稀釋至7.5×106 CFU/mL，向每孔中加100μL，在37℃恒溫培養箱中孵育。此時，1～11孔藥物濃度分別為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125μg/mL。20 h后，觀察96孔培養板中的液體渾濁情況，判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。
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