基于體外重組雞傳染性貧血病毒生長曲線研究復制效率（二）
1.2試驗方法
1.2.1 sgRNA和供體質粒的構建
參考FAdV-4 HB1505毒株的fiber-2基因序列（GenBank登錄號：MZ054256.1），利用sgRNA在線設計網站（http://crispor.tefor.net/）設計靶向fiber-2基因的sgRNA，并克隆到lentiCRISPR v2載體上，通過測序進行sgRNA構建載體的驗證。具體的sgRNA序列見表1，由南京擎科生物科技有限公司合成。以線性化質粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR為載體，以CIAV毒株T1P6基因組為模板擴增CIAV的VP1基因，擴增引物見表2。利用ClonExpress II One Step Cloning Kit通過同源重組構建供體質粒pMD19-HAL-CIAV-VP1-LoxP-RFP-LoxP-HAR。
1.2.2重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的構建策略
使用轉染試劑Mirus將3μg sgRNA和3μg的供體質粒共轉染LMH細胞。轉染12 h后，以0.1 MOI的FA4-EGFP感染LMH細胞。感染病毒3~4 d后，用96孔板將上清液盲傳至新的LMH細胞中，通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光簇。紅色熒光簇出現則表明成功構建重組病毒。通過有限稀釋法和病毒空斑試驗進一步純化出攜帶RFP表達盒的重組病毒。隨后，使用轉染試劑Mirus將4μg pcDNA3.1-Cre轉染LMH細胞。轉染24 h后，以0.1 MOI將純化后的帶RFP紅色熒光的重組病毒感染LMH細胞。通過熒光顯微鏡觀察細胞，挑取無RFP表達且存在病變的LMH細胞，用有限稀釋法或病毒空斑試驗進行進一步純化，最終獲得去除RFP表達盒的重組病毒。
1.2.3重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的IFA檢測
將感染重組病毒的LMH細胞用預冷的固定液（丙酮∶乙醇=3∶2）固定5 min，然后用PBS稀釋的單克隆抗體2E3和抗FAdV-4的多克隆抗體雞血清與固定的LMH細胞在37℃下共孵育45 min。PBS洗滌3次后，用羊抗鼠lgG-FITC和羊抗雞lgG-FITC與LMH細胞再共孵育45 min。PBS洗滌3次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察有無特異性紅色和綠色熒光。
1.2.4重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的Western blot檢測
用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解感染重組病毒的LMH細胞。將細胞裂解物上清煮沸10 min后，離心5 min。經SDS-PAGE后，將蛋白轉移到硝酸纖維素（NC膜）上。室溫下，用含5%脫脂乳的PBST封閉NC膜2 h后，用單克隆抗體2E3、1B5和1C9分別孵育NC膜2 h。用PBST洗滌3次后，用HRP標記的山羊抗小鼠IgG孵育1 h。PBST洗滌3次后，用化學發光試劑顯像，利用全自動化學發光圖像分析系統成像。
1.2.5重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的生長曲線測定
將構建的重組病毒和野生型FAdV-4分別以0.1 MOI劑量感染LMH細胞。2 h后換成1%維持液，在感染后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h收取細胞上清液，使用單克隆抗體3B5進行免疫熒光試驗（IFA）測定每個時間點的病毒效價。
1.3統計與分析
采用Reed-Muench法計算病毒的TCID50，利用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析并繪制病毒的生長曲線，采用Student t檢驗進行顯著性方差分析。當P<0.05時，表示結果具有顯著性差異。
2結果與分析
2.1帶RFP的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP的拯救
構建靶向fiber-2基因的sgRNA，以CIAV毒株T1P6基因組為模板擴增CIAV的VP1基因（見圖2）以及以線性化質粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR為模板通過同源重組構建供體質粒pMD19-HAL-CIAV-VP1-LoxP-RFP-LoxP-HAR。然后，按照1.2.2步驟進行重組病毒拯救。感染模板病毒3~4 d后，將上清液繼續盲傳，通過熒光顯微鏡觀察到紅色熒光簇（見圖3A），表明成功拯救出帶RFP的重組病毒，命名為rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP。隨即通過有限稀釋和病毒空斑試驗獲得純化的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP。
2.2表達VP1蛋白的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的鑒定
通過多次轉染pcDNA3.1-Cre，重組病毒感染的LMH細胞在熒光顯微鏡下已經觀察不到其中的紅色熒光簇。PCR進一步證明，通過Cre重組酶處理，成功獲得了去除rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP中的RFP表達盒的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，PCR擴增條帶大小均與預期一致（見圖4）。重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的IFA和Western blot檢測結果見圖5和圖6。抗FAdV-4多克隆抗體雞血清能與感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH細胞發生特異性反應，出現綠色熒光（見圖5A）。同時，VP1特異性單克隆抗體2E3同樣能特異性地與感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH細胞反應，出現紅色熒光（見圖5B）。合并圖中綠色熒光和紅色熒光幾乎完全重疊（見圖5C）。Western blot結果顯示，VP1特異性單克隆抗體2E3能識別感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH細胞中表達的VP1蛋白（見圖6）。上述結果表明重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1獲得了純化，且rFAdV-4-CIAV-VP1能有效表達VP1蛋白。
2.3重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的生長曲線測定
由圖7可知，rFAdV-4-CIAV-VP1在易感細胞LMH中的復制能力遠低于野生型FAdV-4，Student t檢驗顯示存在極顯著差異（P<0.001）。野生型FAdV-4病毒效價可達到10?·?TCID??/mL，而rFAdV-4-CIAV-VP1的病毒效價僅為10?TCID??/mL。
注：表示差異顯著（P<0.05），表示差異極顯著（P<0.01），表示差異極顯著（P<0.01）。