雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗、益生特性試驗及安全性評價（二）
1.3.2膽鹽耐受能力試驗
將上述供試菌懸液按照2%（v/v）的接種量接種于膽鹽濃度0.3%的MRS培養基中，37℃厭氧培養24 h，使用Biosense自動生長曲線分析系統于600 nm處測定A值。選取生長12 h后菌體密度增長較大的菌株進行后續試驗。
1.3.3模擬人工胃腸液試驗
選擇耐受性較好的雙歧桿菌菌株，按照上述試驗方法制成供試菌懸液，人工胃液、人工腸液配置及實驗方法參照Liu等所用方法進行，計算存活率。胃液存活率（%）=N1/N0×100%，腸液存活率（%）=N2/N1×100%，式中：N0表示0 h的活菌數（CFU/mL），N1表示在胃液中培養3 h的活菌數（CFU/mL），N2表示在腸液中培養4、8 h的活菌數（CFU/mL）。
1.3.4表面疏水性測定
采用碳氫吸附法，對菌株的表面疏水性進行測定，培養至3代的菌液以3 505×g離心5 min后棄上清液，無菌PBS緩沖溶液洗滌2次后重懸，調整菌懸液濃度使其在600 nm處的A值為1.0，菌懸液加入等體積二甲苯，震蕩使其充分混勻，靜置60 min使之分層，于600 nm處測得下層A1值，計算菌株疏水性。菌株疏水性（%）=（1?A1/A0）×100%，式中：A0為初始吸光度，A1為處理后吸光度。
1.3.5菌株表面自聚集能力測定
對菌株進行表面自聚集能力測定，按1.3.4所述方法制備菌懸液，37℃厭氧培養，于0、2、4、6、8、12、24 h分別測定菌懸液上層在600 nm處的A值，計算菌株自聚集能力。菌株自聚集能力（%）=（1?At/A0）×100%，式中：A0為初始吸光度，At為t時間吸光度。
1.3.6抑菌能力測定
選取大腸埃希菌等4種致病菌作為指示菌，使用牛津杯法檢測雙歧桿菌對致病菌的抑菌能力，觀察抑菌圈，直至抑菌圈清晰停止培養，測量并記錄抑菌圈直徑。
1.4安全性評價
1.4.1抗生素耐藥性測定
使用藥敏紙片瓊脂擴散法測定雙歧桿菌對20種抗生素的敏感性，測量并記錄抑菌圈直徑。
1.4.2溶血試驗
將活化后菌株劃線于體積分數6%的脫纖維綿羊血固體平板上，37℃培養48 h，并進行陽性對照（金黃色葡萄球菌），記錄菌株生長情況。
1.4.3菌株全基因組測序和注釋
將菌株于MRS液體培養基中活化并傳代培養，按1.2.1所述方法收集菌體細胞，經液氮極冷后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組測序。對原始測序數據進行過濾，使用SOAP denovo v 2.0軟件對高質量reads進行組裝，以基因組大小、Saffold數量、GC含量作為指標進行評估，采用CapCloser軟件對內部Gap進行填充和單堿基校正，完成組裝。基于毒力基因數據庫（VFDB）對菌株FYF41-14蛋白序列進行比對，設置參數閾值為相似度＞85%、E值＜1e-15、序列匹配長度＞300 bp?；诰C合抗生素耐藥基因數據庫（CARD）對菌株FYF41-14蛋白序列進行比對，設置參數閾值為相似度＞85%、E值＜1e-15、序列匹配長度＞300 bp。
1.5統計學方法
每組實驗設置3個平行，應用SPSS 26.0軟件進行顯著性分析。符合正態分布的計量數據用平均值±標準差表示，兩樣本以上數據比較采用單因素方差分析，計數資料采用百分率表示，組間樣本均數比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2.結果
2.1雙歧桿菌分離鑒定
對樣本進行分離純化后，獲得239株疑似雙歧桿菌，菌落形態呈現邊緣整齊、表面光滑或粗糙3種形態，顏色多為白色、乳白色或淡黃色的圓形菌落，且239株菌均為革蘭陽性菌。顯微鏡觀察發現菌體細胞多數呈現V型或Y型桿狀。
利用DNA提取試劑盒提取雙歧桿菌基因組DNA，利用紫外分光光度計進行DNA濃度和純度的檢測，結果顯示所有菌株DNA濃度均在100～3 000 ng/L，純度（A260/A280）均在1.8～2.0，表明菌株DNA提取成功。進一步對檢測合格的DNA片段采用PCR進行擴增，并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示，所有菌株在1 500 bp處均有明亮清晰的條帶，且無拖尾現象。綜上表明分離株16S rRNA基因的PCR擴增產物滿足后續的測序和分析要求。
測序得到菌株序列，通過NCBI數據庫中已有數據對序列進行同源性比對，將同源性大于99%的菌株與同一種水平的模式株進行系統發育關系分析，部分菌株的系統發育結果如圖1所示，239株菌株均鑒定為雙歧桿菌。
圖1雙歧桿菌系統發育樹
鑒定結果如圖2A所示，其中數量最多為長雙歧桿菌（57.32%），其次為假小鏈雙歧桿菌（17.99%），齒雙歧桿菌數量最少（0.42%）。兒童樣本共計分離到107株，隸屬6個種，優勢菌種為長雙歧桿菌（56.07%）。成人樣本中分離得到132株，包括5個種，優勢菌種為長雙歧桿菌（58.33%）。值得關注的是，短雙歧桿菌、齒雙歧桿菌僅在兒童樣本中存在，兩歧雙歧桿菌僅在成人樣本中存在。
圖2雙歧桿菌分離鑒定情況
注：A為不同年齡段樣本雙歧桿菌分離鑒定結果；B為不同培養基雙歧桿菌分離情況。
分析不同培養基對可培養物種豐富度的影響，結果如圖2B所示，我們發現MRSC共計分離到100株（41.84%），BHI為43株（17.99%），其余培養基為MRS（17.15%）、LRIM（12.13%）、LBS（8.79%）、RCM（2.09%），LF、LA中未分離得到雙歧桿菌，MRSC、BHI兩種培養基的雙歧桿菌分離率和分離物種豐富度均較高，MRSC可分離到7個種的雙歧桿菌，BHI可分離到5個種。
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