甘肅隴南油橄欖葉提取物對(duì)幾種常見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響
隨著抗生素類和磺胺類等抗菌藥物的大量使用，細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。因此，研發(fā)高效、廣譜、低殘留、低毒的藥物將成為防治細(xì)菌感染類疾病的重中之重。研究發(fā)現(xiàn)中藥或天然植物提取物可抑制或直接殺滅病原菌而不產(chǎn)生耐藥性[6-7]，因此抗菌中藥逐步成為研究熱點(diǎn)。而橄欖苦苷作為一種裂環(huán)烯醚萜類化合物，對(duì)細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制效果。本文以甘肅隴南油橄欖葉提取物(Olive leaves extract，OLE)為試樣，分析其對(duì)幾種常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌活性，為油橄欖葉提取物制備成抗菌制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
測(cè)試方法
采用稀釋法[10]分析OLE對(duì)8種供試細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響。依次將菌懸液和不同質(zhì)量濃度的OLE溶液加入滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔6 h置于超凈工作臺(tái)內(nèi)取樣一次，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
測(cè)試結(jié)果
OLE對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響(見(jiàn)圖1)
注：A為蠟狀芽孢桿菌，B為枯草芽孢桿菌。
由圖1(A)可知，在不添加OLE的培養(yǎng)基中，蠟狀芽孢桿菌在培養(yǎng)12 h后細(xì)菌生物量的積累明顯加快，12～30 h為蠟狀芽孢桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。添加OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL溶液的培養(yǎng)基中蠟狀芽孢桿菌在培養(yǎng)18 h后適應(yīng)環(huán)境并快速繁殖，在18～24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與對(duì)照組比較，此時(shí)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相對(duì)延緩，說(shuō)明OLE對(duì)蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。當(dāng)添加OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液時(shí)，培養(yǎng)到18 h后蠟狀芽孢桿菌開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，在培養(yǎng)18～24 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但菌體濃度低于5 mg/mL組，表明蠟狀芽孢桿菌隨著OLE質(zhì)量濃度的增加，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被相應(yīng)延緩或推遲。由圖1(B)可知，當(dāng)不添加OLE時(shí)，培養(yǎng)到6 h后枯草芽孢桿菌開(kāi)始增長(zhǎng)，在培養(yǎng)6～30 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，在培養(yǎng)18 h后枯草芽孢桿菌快速生長(zhǎng)并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)24 h后枯草芽孢桿菌增長(zhǎng)明顯加快，24～30 h為快速生長(zhǎng)期。表明隨著OLE質(zhì)量濃度的增加，枯草芽孢桿菌的延遲期增長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延后。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別為12～30 h、6～30 h，添加不同質(zhì)量濃度的OLE后均可延緩蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。生長(zhǎng)曲線遲緩期的長(zhǎng)短主要因菌種、接種量、菌齡及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等不同而異。本實(shí)驗(yàn)中遲緩期延長(zhǎng)的原因可能是OLE中的活性成分作為菌體生長(zhǎng)的抑制劑對(duì)其生長(zhǎng)起到了抑制作用。
OLE對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響(見(jiàn)圖2)
注：A為抗四環(huán)素大腸桿菌，B為大腸桿菌。
由圖2可知，抗四環(huán)素大腸桿菌組和大腸桿菌組的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)趨于一致。不添加OLE時(shí)，培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開(kāi)始快速增長(zhǎng)并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，抗四環(huán)素大腸桿菌和大腸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為18～30 h，此時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被延緩，細(xì)菌生長(zhǎng)速率減慢且所需時(shí)間范圍變寬。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，抗四環(huán)素大腸桿菌和大腸桿菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加，在18～30 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，但菌體濃度低于5 mg/mL組。圖2(A)表明添加OLE既可以延緩抗四環(huán)素大腸桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，又可以降低其菌體生長(zhǎng)量，OLE對(duì)該菌株有較強(qiáng)的抑制作用。圖2(B)表明OLE對(duì)大腸桿菌的抑制作用相對(duì)較弱。油橄欖葉中酚類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗癌作用，此外還有廣泛的抑菌和抗氧化作用，如橄欖苦苷、蘆丁、咖啡酸等及其一定比例混合物均顯示較強(qiáng)的體外活性，具有聯(lián)合抗菌作用。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物中的橄欖苦苷和咖啡酸均表現(xiàn)出對(duì)微生物的抑制作用，且組合酚類化合物的抗菌效果顯著高于酚類化合物單體。
OLE對(duì)葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響(見(jiàn)圖3)
注：A為表皮葡萄球菌，B為金黃色葡萄球菌(SH7)，C為金黃色葡萄球菌。
由圖3(A)可知，不添加OLE的培養(yǎng)基中表皮葡萄球菌培養(yǎng)12 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)24 h時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)期，之后細(xì)菌數(shù)開(kāi)始快速降低。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，表皮葡萄球菌在培養(yǎng)18 h之后細(xì)菌數(shù)增加較快，18 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)30 h后達(dá)到最大菌液濃度，此時(shí)表皮葡萄球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相對(duì)對(duì)照組被延緩，說(shuō)明OLE對(duì)表皮葡萄球菌有一定抑菌作用。在OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，表皮葡萄球菌在培養(yǎng)6 h后繁殖較快，數(shù)目增加明顯，18 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)30 h后細(xì)菌數(shù)開(kāi)始下降。由圖3(B)可知，當(dāng)不添加OLE時(shí)，金黃色葡萄球菌(SH7)在開(kāi)始培養(yǎng)后持續(xù)快速增長(zhǎng)。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)6 h細(xì)菌開(kāi)始適應(yīng)環(huán)境，12 h后快速生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期出現(xiàn)在培養(yǎng)12～36 h之間。OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌(SH7)生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)與5 mg/mL組相一致。由圖3(C)可知，不添加OLE時(shí)，培養(yǎng)6 h后金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)12 h后金黃色葡萄球菌菌數(shù)開(kāi)始增加，18 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，相比對(duì)照組，此時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被延緩，細(xì)菌生長(zhǎng)速率減慢。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加，于18 h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。以上結(jié)果表明，OLE對(duì)葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期均具有延緩作用。吳遵秋等[12]利用稀釋法分析了橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，結(jié)果顯示橄欖苦苷對(duì)3種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響均表現(xiàn)為延緩細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與本研究結(jié)果類似。植物源提取的酚類物質(zhì)具有廣譜的抑菌性，特別是黃酮類化合物，從不同物種中提取的黃酮類化合物抑菌作用均不相同。橄欖黃酮對(duì)變形桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用更強(qiáng)；橄欖黃酮對(duì)牛乳中微生物的活動(dòng)同樣具有抑制作用，而且隨著橄欖黃酮濃度的增加，抑菌作用明顯增加[15]。OLE對(duì)細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的延緩作用是其中多種活性物質(zhì)相互協(xié)同作用的結(jié)果。
OLE對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響(見(jiàn)圖4)
圖4不同質(zhì)量濃度OLE對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響
由圖4可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)抑制作用較小，但是當(dāng)OLE質(zhì)量濃度增至10 mg/mL時(shí)，生長(zhǎng)抑制作用較明顯，尤其是在生長(zhǎng)后期。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OLE對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)抑制作用與其質(zhì)量濃度直接相關(guān)。已有的研究顯示橄欖黃酮和橄欖多酚對(duì)桿菌、葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著濃度的增加抑菌作用明顯增加[15-16]。因此，橄欖葉提取物中有效成分濃度與抑菌活性之間存在顯著的正相關(guān)性。
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