雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗(yàn)、益生特性試驗(yàn)及安全性評(píng)價(jià)（三）
2.2雙歧桿菌菌株耐受特性篩選
2.2.1雙歧桿菌耐受酸和耐膽鹽能力測(cè)定
結(jié)果如圖3所示。以菌體密度增長(zhǎng)量高于或與對(duì)照菌株相比差異不顯著作為篩選標(biāo)準(zhǔn)（V9在pH 3.0環(huán)境下厭氧培養(yǎng)12 h后菌體密度增長(zhǎng)量為0.076，P＞0.05），結(jié)果見圖3A，共篩選得到23株雙歧桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，其中假小鏈雙歧桿菌、齒雙歧桿菌不在可食用菌株名單中，因而最終選擇17株菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)17株pH 3.0酸性環(huán)境耐受能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行耐受0.3%膽鹽濃度試驗(yàn)，結(jié)果如圖3B所示，我們發(fā)現(xiàn)菌株MM28-5、FYF11-36、FYF23-17、SM035-3、FYF41-14培養(yǎng)12 h后菌體密度增長(zhǎng)較高，因此選定該5株菌株進(jìn)行模擬人工胃腸液耐受能力測(cè)定試驗(yàn)。
圖3雙歧桿菌在pH 3.0、膽鹽0.3%環(huán)境中耐受情況
2.2.2模擬人工胃腸液耐受性試驗(yàn)
結(jié)果如表2所示，對(duì)上述5株雙歧桿菌進(jìn)行模擬人工胃腸液試驗(yàn)，結(jié)果表明，模擬胃液環(huán)境培養(yǎng)3 h后5株雙歧桿菌活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中菌株FYF23-17胃液3 h存活率最高，為61.14%，菌株FYF41-14次之，為50.92%，菌株FYF11-36最少，僅有16.98%。經(jīng)模擬腸液環(huán)境培養(yǎng)8 h后，菌株FYF41-14腸液8 h存活率為23.14%，菌株MM28-5次之，為18.07%，菌株FYF11-36和SM035-3存活率未達(dá)到10.00%，因此選取存活率較高的菌株FYF23-17、FYF41-14、MM28-5進(jìn)行益生特性的篩選。
表2體外模擬人體胃腸液存活率
2.3雙歧桿菌菌株益生特性試驗(yàn)
2.3.1表面疏水性
圖4結(jié)果表明，菌株FYF41-14疏水率最高，為35.35%，菌株MM28-5疏水率為23.50%，菌株FYF23-17疏水率為25.10%，菌株FYF41-14疏水率顯著高于菌株MM28-5、FYF23-17（t=29.802、38.002，均P＜0.001）。
圖4菌株表面疏水率
2.3.2表面自聚集能力
結(jié)果如圖5所示，菌株MM28-5在24 h后自聚集率為50.80%，菌株FY41-14在24 h后自聚集率為49.28%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.521，P＞0.050），菌株FYF23-17自聚集率最低，為34.06%，顯著低于菌株MM28-5和FY41-14（t=20.882、42.215，均P＜0.050）。
圖5菌株表面自聚集能力
2.3.3抑菌能力
對(duì)菌株FYF23-17、MM28-5和FY41-14進(jìn)行抑菌能力測(cè)定，結(jié)果見圖6所示，菌株FYF41-14抑制沙門菌能力顯著高于其他菌株（t=6.971、13.380，均P＜0.050），對(duì)于志賀菌的抑制能力顯著高于菌株MM28-5（t=3.738，P=0.020），3個(gè)菌株在抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌能力之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖6菌株抑菌試驗(yàn)結(jié)果
2.4安全性評(píng)價(jià)
2.4.1抗生素耐藥性
結(jié)果如表3所示。菌株FYF41-14對(duì)丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素及新霉素不敏感，對(duì)其余種類抗生素具有一定的敏感性，表明其具有一定的安全性。
表3菌株抗生素耐藥性試驗(yàn)結(jié)果
2.4.2溶血試驗(yàn)
菌株FYF41-14生長(zhǎng)72 h后無顯著變化，不存在溶血圈，認(rèn)為其為γ?溶血，不具有溶血活性，對(duì)照菌株金黃色葡萄球菌有顯著透明抑菌圈，證明其為β?溶血。
2.4.3菌株FYF41-14全基因組信息
為了確定菌株FYF41-14的分類學(xué)地位，排除其為已知益生菌，對(duì)其基因組特征和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序并組裝，結(jié)果顯示，該菌株全基因組序列大小為2.19 Mb，平均GC含量為60.21%，整個(gè)基因組共注釋到1 918個(gè)蛋白編碼基因（CDS），3個(gè)rRNA基因和57個(gè)tRNA基因。進(jìn)一步從基因組角度探究該菌株的安全性，將菌株蛋白序列與CARD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株檢出2種抗性基因，分別為莫匹羅星抗性基因Bbif_ileS_MUP和利福平抗性基因rpoB2，二者均為雙歧桿菌特有的抗生素抗性基因。將菌株蛋白序列與VFDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株未檢索到毒力因子，推測(cè)該菌株不存在致病基因，提示菌株FYF41-14具有一定的安全性。菌株FYF41-14序列與長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種模式株及部分優(yōu)良菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果見圖7，菌株FYF41-14與長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種聚為一個(gè)分支，表明FYF41-14為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種。
圖7長(zhǎng)雙歧桿菌FYF41-14系統(tǒng)發(fā)育樹
3.討論
雙歧桿菌作為人體腸道菌群的重要組成部分，具有改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、抑制有害菌的生長(zhǎng)等多種益生功能，從而維護(hù)腸道菌群平衡與健康。大量體外和臨床研究表明攝入特定雙歧桿菌菌株對(duì)宿主健康可產(chǎn)生有益影響，目前，我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良特性雙歧桿菌菌株數(shù)量較少，因而分離保藏雙歧桿菌菌株，并從中篩選優(yōu)良特性的雙歧桿菌對(duì)豐富我國(guó)雙歧桿菌菌種資源有著重要意義。
本研究招募健康人群，從其糞便樣本中分離鑒定雙歧桿菌，通過耐受性試驗(yàn)、益生特性試驗(yàn)篩選具有益生特性的雙歧桿菌，并驗(yàn)證其安全性。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以發(fā)現(xiàn)，各分支聚類同源相似性均大于95%，其中，Bifidobacterium longum subsp.suis ATCC 27533（M58743）和Bifidobacterium longum subsp.iuvenis NCC 5000（OP696622）兩亞種聚到一起，這是由于Bifidobacterium longum subsp.iuvenis是從Bifidobacterium longum subsp.suis中新劃分出的亞種，親緣關(guān)系較為接近。
本研究選擇較為常見的營(yíng)養(yǎng)豐富或可用于厭氧菌株分離的8種培養(yǎng)基，當(dāng)前分離篩選具有特定益生功能的菌株是獲得潛在益生菌的重要方法，有研究發(fā)現(xiàn)在分離菌株時(shí)設(shè)定適宜的培養(yǎng)條件，更易獲得目標(biāo)菌株。由于雙歧桿菌分離較為困難，本研究通過對(duì)不同培養(yǎng)基雙歧桿菌分離率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)分離雙歧桿菌適宜培養(yǎng)基為MRSC，其分離種類最豐富，數(shù)量最多，這是因?yàn)镸RSC中添加了還原劑L?半胱氨酸鹽酸鹽，其在維持低氧化還原電位的同時(shí)，還可以補(bǔ)充半胱氨酸以促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)。LA、LF培養(yǎng)基未分離得到雙歧桿菌，可能是由于其組成成分無法使雙歧桿菌正常生長(zhǎng)。鐘智等的研究發(fā)現(xiàn)不同短雙歧桿菌菌株對(duì)部分抗生素敏感程度存在差異，且對(duì)萬古霉素、慶大霉素等抗生素具有一定的耐藥性。馬昕瑋等對(duì)48株假小鏈雙歧桿菌耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)上述2種抗生素也具有一定耐受能力。有研究表明青春雙歧桿菌對(duì)鏈霉素有耐藥性。雙歧桿菌可產(chǎn)生胞外多糖以獲得對(duì)部分抗生素的耐藥性，如增加其胞外多糖產(chǎn)量可增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性，但也有研究發(fā)現(xiàn)除個(gè)別種類抗生素外，不同種雙歧桿菌對(duì)抗生素的敏感程度存在株間差異。綜合來看，LA、LF培養(yǎng)基不適用于糞便樣本中雙歧桿菌的分離，通過使用抗生素對(duì)分離特定種屬雙歧桿菌菌株的目標(biāo)仍需進(jìn)一步研究。有研究表明，長(zhǎng)雙歧桿菌為人體腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌株，在各年齡段人群腸道環(huán)境中普遍存在，青春雙歧桿菌與假小鏈雙歧桿菌被認(rèn)為是成人型雙歧桿菌，多在成人樣本中分離得到，本實(shí)驗(yàn)中也得到相似結(jié)果，這表明不同種雙歧桿菌由于其種屬特性可能更適宜在特定人群樣本中分離得到。短雙歧桿菌在除LA、LF以外的6種培養(yǎng)基中分離得到，這表明短雙歧桿菌相比其他種雙歧桿菌可能具有更廣泛的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用能力，不同種雙歧桿菌因其種間特異性對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用偏好也不盡相同，如兩歧雙歧桿菌由于其對(duì)母乳低聚寡糖的專性代謝特性更宜在嬰幼兒腸道環(huán)境中分離。
人體胃腸液構(gòu)成了一個(gè)從極度酸性到堿性的連續(xù)極端環(huán)境，胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等都可能在消化過程中導(dǎo)致菌體細(xì)胞的死亡。這對(duì)攝入益生菌的生存與功效形成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，因此本團(tuán)隊(duì)以益生菌Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9作為對(duì)照，從239株雙歧桿菌中篩選在pH 3.0、膽鹽濃度0.3%條件下耐受性較好的菌株，并通過人工胃腸液試驗(yàn)，篩選得到3株存活率較高的長(zhǎng)雙歧桿菌，耐受性試驗(yàn)表明菌株FYF41-14具有良好耐酸性，可能具有某些益生功能，而耐酸能力較好的菌株可更好發(fā)揮其益生作用。有研究認(rèn)為，菌株發(fā)揮其益生功能受黏附能力影響，通過測(cè)定疏水性與自聚集能力判斷菌株是否具有較高的黏附能力，菌株表面疏水性與其腸道黏附能力呈現(xiàn)正相關(guān)，疏水性越高，其黏附能力越強(qiáng)，而自聚集是指當(dāng)細(xì)菌在環(huán)境中處于某種特定條件時(shí)，其內(nèi)部會(huì)發(fā)生的一種聚集現(xiàn)象。菌株自聚集率越高，表明其黏附能力越強(qiáng)。有研究認(rèn)為二者可相互影響，且多數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中菌株FYF41-14具有良好的疏水性（35.35%）和自聚集能力（49.28%），表明其具有較高的腸道黏附潛力，從而可以在腸道環(huán)境內(nèi)通過競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)、生成短鏈脂肪酸等多種方式抑制潛在致病菌的生長(zhǎng)，并起到調(diào)節(jié)菌群構(gòu)成、維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)的作用。益生菌應(yīng)具有安全性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株FYF41-14可對(duì)多數(shù)抗生素類藥物敏感，未攜帶有致病基因，且不具有溶血活性。將菌株FYF41-14序列與部分優(yōu)良菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)菌株FYF41-14與長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種聚為一個(gè)分支，表明FYF41-14為長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種。同時(shí)，其與模式株和優(yōu)良菌株位列不同的分支，綜合前期實(shí)驗(yàn)表明該菌株為未被深入探索且具有潛在益生特性的雙歧桿菌。
綜上所述，從健康人群糞便樣本中分離鑒定雙歧桿菌，通過耐受性試驗(yàn)、益生特性試驗(yàn)及安全性驗(yàn)證，最終篩得1株具有良好益生特性的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種FYF41-14，可為人源益生菌的開發(fā)利用提供候選菌株。
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