不同霉變時期肉豆蔻飲片需氧菌、霉菌、酵母菌菌落總數統計（二）
2.3.2霉菌、酵母菌培養基適用性試驗
分別移取黑曲霉、白色念珠菌菌液1 mL（含菌量50-100 cfu）至滅菌平皿中，分別傾倒沙氏葡萄糖瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養基15 mL，待其凝固后，倒置于恒溫培養箱中20-25℃培養72 h。每個菌種每種類型培養基各做3個平行。測定菌落數。
被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數比值應在0.5-2范圍內，且菌落形態大小與應與對照培養基上的菌落一致。結果（表2，圖3），被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數均在0.5-2范圍內。被檢固體培養基上菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致。
2.4計數方法適用性試驗
2.4.1需氧菌總數計數方法適用性試驗
試驗組：分別移取1∶1000、1∶10000、1∶100000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu。從試管中移取1 mL至滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，待其凝固后倒置于霉菌培養箱中30-35℃培養48 h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數。
圖3 a黑曲霉；b白色念珠菌
表3需氧菌總數計數方法適用性試驗結果
供試品對照組：分別移取1∶1000、1∶10000、1∶100000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入0.1 mL無菌生理鹽水，其余按試驗組操作。測定供試品對照組菌落數。
菌液對照組：取9.9 mL無菌生理鹽水于滅菌試管中，加入與試驗組相同的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，其余按試驗組操作。測定菌液對照組菌落數，進行微生物回收試驗。
陰性對照組：移取1 mL無菌生理鹽水于滅菌平皿中，其余按試驗組操作。平行制備2個平皿。
按回收率=[（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數]計算回收率，結果（表3）。根據2015年版《中國藥典》，采用平皿法時，回收率應在0.5-2范圍內。可得出，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉需稀釋至1∶10000，白色念珠菌需稀釋至1∶100000方能達到回收率要求。
2.4.2霉菌、酵母菌總數計數方法適用性試驗
分別移取1∶10000、1∶100000、1∶1000000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的黑曲霉、白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu。從試管中移取1 mL至滅菌平皿中，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，待其凝固后倒置于霉菌培養箱中20-25℃培養72 h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數。
同法測定供試品對照組、菌液對照組和陰性對照組菌落數。
按回收率=[（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數]計算回收率，結果（表4）。根據2015年版《中國藥典》，采用平皿法時，回收率應在0.5-2范圍內?？傻贸?，黑曲霉需稀釋至1∶10000，白色念珠菌需稀釋至1∶1000000方能達到回收率要求。
表4霉菌、酵母菌總數計數方法適用性試驗結果
表5不同霉變程度肉豆蔻飲片菌落總數
2.5不同霉變程度樣品菌落總數測定
綜上，選用1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四個稀釋度的供試液來測定不同霉變程度肉豆蔻飲片中需氧菌、霉菌及酵母菌的菌落總數。結果（表5）。顯示，隨著加速時間的延長，肉豆蔻樣品中需氧菌菌落總數、霉菌、酵母菌菌落總數均呈上升趨勢，且增長迅速。
3討論
實驗結果表明金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉采用1:10普通平皿法進行方法適用性驗證時，菌落數量較多，難以計數，不適合作為肉豆蔻飲片的微生物計數方法。經試驗選用1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四個稀釋度來進行肉豆蔻飲片微生物計數的方法學驗證。其中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌需稀釋至1∶10000回收率可達到要求，而銅綠假單胞菌需稀釋至1∶100000稀釋級，才能達到回收率要求。黑曲霉和白色念珠菌分別在1∶10000、1∶100000稀釋級時才能達到回收率要求。
通過對不同霉變程度肉豆蔻飲片微生物計數結果研究發現，隨著加速時間的延長，肉豆蔻飲片霉變現象逐漸嚴重，且需氧菌和霉菌、酵母菌菌落總數均呈上升趨勢，且加速0-6天時增長緩慢，6-9天呈爆發式增長，9-39天勻速增長。提示我們肉豆蔻作為常用藥食兩用藥材在儲藏過程中應實時監控其菌落總數，必要時增設微生物限度檢查以保證用藥的安全性與有效性。
有文獻報道，中藥飲片普遍受到多種微生物的污染，污染程度十分嚴重且污染的優勢菌屬大都是已知的產毒霉菌，因此在后續研究中應進一步研究肉豆蔻在霉變過程中產毒霉菌及控制菌的變化規律，及霉變產生的菌株對肉豆蔻飲片藥效成分含量的影響，為建立更完善的肉豆蔻飲片質量標準提供依據。
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