?鯽魚(yú)出血病致病菌嗜水氣單胞菌分離及藥敏試驗(yàn)結(jié)果
鯽魚(yú)出血病，一般認(rèn)為由嗜水氣單胞菌引起，嗜水氣單胞菌感染鯽魚(yú)后，在魚(yú)體質(zhì)變差和水質(zhì)惡化時(shí)，在魚(yú)體內(nèi)快速增殖，引起全身出血的癥狀。目前治療出血病主要還是依靠投喂抗生素，但生產(chǎn)中多數(shù)養(yǎng)殖戶(hù)根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)使用抗生素，往往效果較差，疾病難以快速治愈，不僅造成養(yǎng)殖戶(hù)的損失，還導(dǎo)致鯽魚(yú)抗生素超標(biāo)，影響食品安全。
江蘇大豐某鯽魚(yú)精養(yǎng)塘口2018年8月初開(kāi)始發(fā)病，我們?nèi)臃蛛x病原菌并鑒定，對(duì)分離的病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以指導(dǎo)養(yǎng)殖戶(hù)科學(xué)用藥，得到良好的治療效果。
1材料與方法
1.1材料
發(fā)病鯽魚(yú)2018年8月取自大豐鯽魚(yú)精養(yǎng)塘口，200g左右，發(fā)病期間出現(xiàn)鯽魚(yú)持續(xù)死亡，死亡鯽魚(yú)體表充血，腹腔內(nèi)有腹水，初步診斷為鯽魚(yú)出血病。試驗(yàn)用藥敏紙片采購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；PCRMix、溴化乙錠（EB）、Marker 2000、細(xì)菌基因組提取試劑盒采購(gòu)自北京艾德萊；用于擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的引物由上海生工合成；微生物培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），pH7.4±0.2，采購(gòu)自O(shè)XOID。
1.2致病菌的分離
在超凈工作臺(tái)中，用酒精燈灼燒后的接種環(huán)從患病魚(yú)肝、腎、腦等組織處取樣，涂布在培養(yǎng)基平皿上，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑選優(yōu)勢(shì)菌落接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?
1.3回歸攻毒實(shí)驗(yàn)
將分離到的致病菌接種到BHI液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，用生理鹽水將菌液稀釋至108cfu/mL備用。取健康鯽魚(yú)60尾，隨機(jī)分為兩組，每組30尾。試驗(yàn)組每尾注射0.2mL菌液，對(duì)照組每尾注射0.2mL生理鹽水，飼養(yǎng)10天，每天撈出死亡鯽魚(yú)，記錄死亡數(shù)量，并對(duì)死亡魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌分離。
1.4致病菌鑒定
按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取從患病鯽魚(yú)和攻毒死亡鯽魚(yú)上分離到的致病菌DNA，使用嗜水氣單胞菌16S rDNA引物擴(kuò)增致病菌DNA，正向引物F:GCGGGTACGACGCACCTTGC、逆向引物R:CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA，目的片段長(zhǎng)度為1091bp，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性50 s，59℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增后，用添加EB的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓120V、電泳15分鐘。電泳后使用紫外分析儀觀(guān)察結(jié)果。
1.5藥敏試驗(yàn)
采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法），在超凈工作臺(tái)中，將分離到的致病菌用生理鹽水制備成濃度約107～108cfu/mL細(xì)菌懸濁液，取100μL均勻涂布于BHI平板上，等待15分鐘左右，使細(xì)菌在培養(yǎng)基上定植，然后將不同的藥敏紙片均勻的貼在BHI平板上，30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，觀(guān)察結(jié)果，量取抑菌圈直徑，確定致病菌對(duì)各藥物的敏感性。
2結(jié)果
2.1鯽魚(yú)出血病的發(fā)病情況
發(fā)病塘口位于江蘇大豐，塘口面積90畝，東西朝向，魚(yú)塘四周水泥護(hù)坡，水深2～2.5m，進(jìn)排水配套設(shè)施完善。2018年8月4日開(kāi)始，開(kāi)始每天有十幾尾死魚(yú)，三天后突然增加到一百多尾，死魚(yú)呈典型的出血病狀況，患病魚(yú)腹部，鰭條基部等多處充血，魚(yú)眼球突出，解剖后腹腔內(nèi)有紅色腹水，腸道充血，腸內(nèi)無(wú)食。
2.2回歸攻毒結(jié)果
將分離到的致病菌編號(hào)為HFJY-1，注射到鯽魚(yú)體內(nèi)后，第2天開(kāi)始出現(xiàn)死魚(yú)，第5天鯽魚(yú)全部死亡，死亡率100%，對(duì)照組養(yǎng)殖10天未見(jiàn)死亡，攻毒情況見(jiàn)表1。死亡鯽魚(yú)表現(xiàn)出與患病鯽魚(yú)相同的癥狀，體表、鰭條基部不同程度出血，解剖可見(jiàn)肝臟腫脹充血，有大量腹水。從攻毒死亡鯽魚(yú)肝臟分離的致病菌，與HFJY-1的菌落形態(tài)一致，編號(hào)為HFGD-1。
表1攻毒感染實(shí)驗(yàn)
2.3致病菌的鑒定
從鯽魚(yú)的腎和肝上分離到致病菌，其在BHI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，24小時(shí)后可見(jiàn)明顯菌落，菌落呈圓形，邊緣光滑，淡白色。患病鯽魚(yú)和攻毒鯽魚(yú)致病菌的PCR電泳圖譜中可以看出，HFJY-1和HFGD-1使用嗜水氣單胞菌引物做PCR，在1000bp位置左右出現(xiàn)明顯亮帶，陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，說(shuō)明這兩株致病菌是嗜水氣單胞菌。
2.4致病菌的藥敏分析
使用水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的氟苯尼考、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、硫酸新霉素、土霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明和復(fù)方磺胺嘧啶等8種抗生素對(duì)分離到的兩株致病菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，分離的嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考敏感，紅霉素、強(qiáng)力霉素、硫酸新霉素和復(fù)方磺胺嘧啶中度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明和氨芐青霉素耐藥。
3討論
隨著塘租、飼料、漁藥和人工等成本的逐年增加，養(yǎng)殖戶(hù)放養(yǎng)密度越來(lái)越高，加上缺少科學(xué)的疾病防控理念，細(xì)菌性疾病暴發(fā)越來(lái)越頻繁。我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)門(mén)檻低，多數(shù)的養(yǎng)殖戶(hù)缺乏科學(xué)的用藥理念，甚至一些漁藥廠(chǎng)家的業(yè)務(wù)員都不是水產(chǎn)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)，簡(jiǎn)單培訓(xùn)幾天就指導(dǎo)養(yǎng)殖戶(hù)，往往為了利益胡亂指導(dǎo)。甚至還有養(yǎng)殖戶(hù)使用抗生素進(jìn)行細(xì)菌性疾病的預(yù)防，導(dǎo)致各類(lèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性。
鯽魚(yú)出血病是危害鯽魚(yú)的主要病害之一，隨著多年的抗生素使用，嗜水氣單胞菌已對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。目前，水產(chǎn)上治療細(xì)菌性疾病，主要還是通過(guò)投喂抗生素外加潑灑，但如何選擇正確的抗生素成為治療成敗的關(guān)鍵因素。本文結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌已對(duì)多種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，導(dǎo)致我國(guó)水產(chǎn)品抗生素頻頻超標(biāo)，影響我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，這是多年來(lái)抗生素的亂用濫用造成的。
表2各抗生素藥敏結(jié)果
水產(chǎn)從業(yè)者在治療細(xì)菌性疾病時(shí)，應(yīng)當(dāng)科學(xué)地選擇抗生素，通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)的治療藥物，避免盲目用藥導(dǎo)致疾病無(wú)法有效控制。本文發(fā)病塘口在藥敏實(shí)驗(yàn)后，外用潑灑復(fù)合碘兩次，每次間隔一天，并選擇恩諾沙星作為治療藥物，拌服抗生素后，死亡量大大降低，從每天死亡兩百多條到后來(lái)幾條，5天后沒(méi)有死魚(yú)，沒(méi)有死魚(yú)后繼續(xù)投喂藥餌兩天鞏固治療。在發(fā)生細(xì)菌性疾病時(shí)，不能盲目地使用抗生素，要尊重科學(xué)，用科學(xué)的理念指導(dǎo)養(yǎng)殖用藥，真正做到科學(xué)用藥，減緩致病菌耐藥性的產(chǎn)生。
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