鐵皮、疊鞘石斛提取物對(duì)沙門氏菌生長狀況、群體運(yùn)動(dòng)的影響——結(jié)論與討論、結(jié)論
3 結(jié)論與討論
3.1 石斛提取物對(duì)沙門氏菌的MIC
測(cè)定2種石斛提取物的MIC,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度在亞抑菌濃度梯度下進(jìn)行,確保沙門氏菌的QS抑制效果不是由抑菌效果導(dǎo)致。由圖1可知,鐵皮石斛提取物對(duì)沙門氏菌的MIC為8 mg/mL。疊鞘石斛提取物的MIC為4 mg/mL。
圖1 兩種石斛提取物對(duì)沙門氏菌的MIC
3.2 石斛提取物對(duì)沙門氏菌生長狀況的影響
生長曲線主要包括微生物生長的4個(gè)時(shí)期:遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。微生物在對(duì)數(shù)期的生長速度最大,在此期間內(nèi)大量生長繁殖。通過對(duì)比添加組與未添加組的曲線一致情況,可得知添加物對(duì)沙門氏菌生長繁殖情況的影響程度。由圖2可知,加入亞抑菌濃度的石斛提取物組和未加提取物組的生長曲線幾乎完全重合,說明亞抑菌濃度下的石斛提取物對(duì)沙門氏菌的生長繁殖沒有影響。
a-鐵皮石斛提取物組;b-疊鞘石斛提取物組
圖2 兩種石斛提取物對(duì)沙門氏菌生長狀況的影響
3.3 石斛提取物對(duì)沙門氏菌運(yùn)動(dòng)能力的影響
泳動(dòng)是細(xì)菌遷移的一種重要方式,是指細(xì)菌在瓊脂含量<0.45%的培養(yǎng)基表面遷移。沙門氏菌的泳動(dòng)能力可通過細(xì)菌在泳動(dòng)平板上從接種點(diǎn)向四周擴(kuò)散且遷移直徑表征。細(xì)菌的泳動(dòng)能力有利于細(xì)菌生物膜形成和細(xì)菌在宿主表面黏附聚集。如圖3和圖4所示,當(dāng)加入石斛提取物后,細(xì)菌的遷移直徑明顯縮小,且呈現(xiàn)出劑量依賴性。由表1可知,當(dāng)鐵皮石斛提取物的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí),對(duì)沙門氏菌群集運(yùn)動(dòng)的抑制率為91.33%;當(dāng)疊鞘石斛提取物的質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),對(duì)沙門氏菌群集運(yùn)動(dòng)的抑制能力達(dá)到了48.67%。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)石斛提取物由于含有多糖,會(huì)隨著濃度增高使培養(yǎng)基黏稠度變大,用0.22 μm濾膜過濾后可以消除多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
表1 兩種石斛提取物對(duì)沙門氏菌群集運(yùn)動(dòng)的抑制能力
圖3 疊鞘石斛提取物對(duì)沙門氏菌群集運(yùn)動(dòng)的影響
圖4 鐵皮石斛提取物對(duì)沙門氏菌群集運(yùn)動(dòng)的影響
3.4 石斛提取物對(duì)沙門氏菌生物膜形成的影響
生物膜是細(xì)菌在生長過程中吸附于生長基質(zhì)表面形成的一種包裹在細(xì)菌外面的生物被膜,由菌體和自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。生物膜形成有利于細(xì)菌生長及抗逆性產(chǎn)生。劉旭的實(shí)驗(yàn)表明沙門氏菌生物膜的形成在該病原菌的傳播和感染過程中發(fā)揮重要作用。由圖5可知,2種石斛提取物均抑制沙門氏菌生物膜形成(P<0.01),并且生物膜生長率與石斛提取物濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
圖5 兩種石斛提取物對(duì)沙門氏菌生物膜生成率的影響
注:與對(duì)照組相比,***表示P<0.01。
3.5 石斛提取物成分分析
植物提取物中的黃酮類、多酚類、香豆素類、生物堿類等成分均存在抗菌活性,因其結(jié)構(gòu)和組成差異發(fā)揮不同的QS抑制活性。圖6和圖7中結(jié)果表明,在石斛提取物中共鑒定出3種成分:異鼠李素,金絲桃苷,槲皮素。這些成分均具有抗菌、抗生物膜、抑制QS等多種作用。
a-異鼠李素的出峰時(shí)間;b-金絲桃苷的出峰時(shí)間;c-槲皮素的出峰時(shí)間
圖6 單體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰時(shí)間
a-鐵皮石斛提取物;b-疊鞘石斛提取物
圖7 提取物的HPLC圖
3.6 分子對(duì)接結(jié)果
據(jù)研究報(bào)道,異鼠李素、金絲桃苷、槲皮素等成分均具有QSI活性。根據(jù)HPLC的結(jié)果,選擇異鼠李素、金絲桃苷和槲皮素這3種成分進(jìn)行分子模擬對(duì)接,分析石斛提取物發(fā)揮QSI活性的可能機(jī)制。結(jié)果顯示,異鼠李素、金絲桃苷、槲皮素均能與LuxS受體蛋白結(jié)合,對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為-8、-9.1、-8,對(duì)應(yīng)的結(jié)合能為-5.5、-2.57、-5.53 kJ/mol。結(jié)合能越小,說明對(duì)接能力越強(qiáng)。異鼠李素與LuxS受體的Asn124之間形成氫鍵,金絲桃苷與Cys41、Ile142和Asp141之間形成了氫鍵,槲皮素與受體的Gln127和Leu123之間形成了氫鍵。分子對(duì)接結(jié)果如圖8所示。
a-異鼠李素與LuxS蛋白對(duì)接;b-金絲桃苷與LuxS蛋白對(duì)接;c-槲皮素與LuxS蛋白對(duì)接
圖8 分子對(duì)接結(jié)果
4 結(jié)論
通過生長曲線實(shí)驗(yàn)、泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)、生物膜實(shí)驗(yàn)可知石斛提取物具有明顯抑制沙門氏菌群體行為的作用,且這種抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明石斛提取物可以對(duì)沙門氏菌的運(yùn)動(dòng)能力和耐藥性造成明顯影響。經(jīng)HPLC分析表明,鐵皮石斛提取物和疊鞘石斛提取物均含有異鼠李素、金絲桃苷和槲皮素這3種單體成分,分子對(duì)接結(jié)果表明,石斛提取物的活性單體成分均可與LuxS蛋白進(jìn)行結(jié)合,提示石斛提取物可以通過與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)沙門氏菌的QS系統(tǒng)受體蛋白來抑制沙門氏菌致病基因表達(dá)從而達(dá)到抑制細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力和抗性的作用。
通過以上實(shí)驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn)石斛提取物對(duì)沙門氏菌的QS系統(tǒng)可以產(chǎn)生影響,其作用機(jī)制可能是通過抑制沙門氏菌的QS系統(tǒng)受體蛋白來抑制沙門氏菌致病基因表達(dá),從而達(dá)到抑制沙門氏菌致病侵襲能力的效果。本研究可為鐵皮石斛和疊鞘石斛的功效開發(fā)以及沙門氏菌的新型抑菌劑開發(fā)提供研究方向。
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