金黃色葡萄球菌：紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星時(shí)間-抑菌生長曲線分析（二）
1.4.4濁度法-體外藥物敏感性試驗(yàn)
根據(jù)質(zhì)控菌和試驗(yàn)菌的微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)獲得的MIC值，分別用水稀釋成4個(gè)不同的藥物濃度，備用。向比濁管中按拉丁方排列加入配制好的系列濃度藥物1.00mL，再加入9.00mL適宜濃度的菌懸液，使菌液終濃度為5×105cfu/mL，藥物終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。
表1金黃色葡萄球菌藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍
表2不同藥物濃度拉丁方排列方式
將添加有不同濃度藥物、菌液混懸液的比濁管放入到WBS-100微生物比濁法測定儀中，培養(yǎng)溫度為37℃，監(jiān)測間隔時(shí)間為30min，監(jiān)測時(shí)長為16h，測定實(shí)時(shí)吸光度。試驗(yàn)結(jié)束后通過不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的吸光度值使用Excel繪制其時(shí)間-吸光度抑菌生長曲線。
2結(jié)果與分析
如表3所示，微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)測得的MIC結(jié)果與濁度法測得的結(jié)果無顯著差異，但濁度法試驗(yàn)為實(shí)時(shí)吸光值信號采集，獲得的結(jié)果可能更接近實(shí)際的MIC值，而通過時(shí)間-吸光度曲線進(jìn)行MIC終點(diǎn)判讀則更直觀和準(zhǔn)確。
如圖1所示，3種藥物的分離菌株生長曲線都是前期呈不斷增長的趨勢，到后期明顯逐漸下降，而質(zhì)控菌株呈現(xiàn)增長的趨勢，下降趨勢不明顯；不論是分離菌株還是質(zhì)控菌株，呈現(xiàn)的生長曲線的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC曲線下面積不同；1/8MIC先于1/4MIC進(jìn)入對數(shù)生長期，1/4MIC先于1/2MIC進(jìn)入對數(shù)生長期；紅霉素、慶大霉素的分離菌1/2MIC先于質(zhì)控菌1/2MIC進(jìn)入對數(shù)生長期；氧氟沙星為快速殺菌劑，其1/2MIC進(jìn)入對數(shù)生長期較紅霉素和慶大霉素早。紅霉素為時(shí)間依賴型抗生素，其抑菌時(shí)間比慶大霉素和氧氟沙星都要長。。
通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時(shí)間-抑菌生長曲線分析，可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，其生長趨勢呈現(xiàn)了不同于理論設(shè)想的情況，可能并非是細(xì)菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半。
表3 3種抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MIC
圖1金黃色葡萄球菌在3種抗菌藥物作用下的時(shí)間-吸光度曲線
圖2質(zhì)控菌株ATCC29213在3種抗菌藥物作用下的時(shí)間-吸光度曲線
3討論與結(jié)論
已有研究表明，亞抑菌濃度下細(xì)菌耐藥基因的水平傳播可能性增加，突變株數(shù)量大于野生株數(shù)量，還會(huì)形成生物膜，這些都可導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，而亞抑菌濃度的藥物壓力下，耐藥菌株還會(huì)被選擇性富集，因此亞抑菌濃度下細(xì)菌與藥物的作用關(guān)系很有研究價(jià)值。不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期較低濃度藥物有一定的延遲，目前還不明確金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度下是否會(huì)蓄積不同耐藥機(jī)制的耐藥菌株，即藥物壓力下快速進(jìn)入對數(shù)期的細(xì)菌可能為獲得耐藥性的細(xì)菌。但也有研究證實(shí)，發(fā)生突變的高水平耐藥菌的適應(yīng)性與其親本株相比大多數(shù)出現(xiàn)適應(yīng)性下降；耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現(xiàn)先增長后減小的趨勢；濁度法下的時(shí)間-抑菌生長曲線可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時(shí)間進(jìn)行可視化判定，慶大霉素、氧氟沙星為濃度依賴型，可見不同藥物濃度對細(xì)菌生長繁殖影響較大，而紅霉素為時(shí)間依賴型，隨著時(shí)間的延長，不同藥物濃度的抑菌時(shí)間均比慶大霉素、氧氟沙星長，提示時(shí)間依賴型藥物的抑菌時(shí)間均比濃度依賴型藥物長。
濁度法較微量稀釋法比較具有5點(diǎn)優(yōu)勢：（1）濁度法可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，測定其實(shí)時(shí)吸光值，反映金黃色葡萄球菌生長的動(dòng)態(tài)趨勢，微量稀釋法只能在第2 d觀察結(jié)果；（2）濁度法可以使用現(xiàn)有的濁度分析儀，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集；（3）濁度法結(jié)合振搖培養(yǎng)，保證了藥物與細(xì)菌的充分作用；（4）濁度法終點(diǎn)判讀時(shí)更直觀；（5）濁度法可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時(shí)間進(jìn)行可視化判定。
通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時(shí)間-抑菌生長曲線分析，金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，可能并非是細(xì)菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半；不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期較低濃度藥物有一定的延遲；耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現(xiàn)先增長后減小的趨勢；隨著時(shí)間的延長，不同藥物濃度的紅霉素抑菌時(shí)間均比慶大霉素、氧氟沙星長。
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