林氏扇頭蜱抗菌肽重組蛋白對大腸埃希菌生長曲線影響及抑菌效果（一）
摘要
目的探究林氏扇頭蜱抗菌肽Microplusin-like基因的抗菌功能，為了解林氏扇頭蜱先天免疫系統(tǒng)和開發(fā)蜱類防控藥物、新型抗菌藥物替代提供新的參考依據(jù)。方法根據(jù)林氏扇頭蜱Microplusin-like基因序列設(shè)計特異性引物，提取林氏扇頭蜱RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR擴增基因片段，將基因片段連接至pCold-SUMO質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCold-SUMO/Microplusin-like后，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化后獲得蛋白；通過濾紙片法測定重組蛋白對大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈，通過微量對倍稀釋法測定其對大腸埃希菌、沙門菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），并通過測定該蛋白對大腸埃希菌生長曲線、時間-殺菌曲線的影響探究其抑菌效果；通過掃描電鏡及透射電鏡觀察重組蛋白對大腸埃希菌微觀形態(tài)的影響，并結(jié)合分子對接技術(shù)探究重組蛋白的抑菌機制。結(jié)果林氏扇頭蜱Microplusin-like基因擴增所得片段長度為333 bp，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pCold-SUMO/Microplusin-like，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化后獲得蛋白，大小約為29 kDa。抑菌試驗結(jié)果表明，重組蛋白對大腸埃希菌（ATCC 25922、1515、987P、K88、K99）及雞白痢沙門菌CVCC1791的抑菌圈直徑分別為15.8、20.58、18.33、15.4、18.24、18.18 mm，表現(xiàn)出中度或高度敏感；MIC（MBC）分別為0.625（5）、0.625（>5）、0.625（5）、1.25（>5）、0.625（>5）、0.625（>5）mg/mL，存在一定差異；對金黃色葡萄球菌無抑制作用；生長曲線及時間-殺菌曲線測定發(fā)現(xiàn)，重組蛋白抑菌活性呈濃度依賴性。掃描及透射電鏡顯示經(jīng)重組蛋白處理后大腸埃希菌菌體皺縮，邊緣模糊，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，內(nèi)容物外泄，細(xì)胞內(nèi)部松散。分子對接顯示蛋白通過氫鍵、鹽橋及疏水作用與大腸埃希菌外膜脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)合。結(jié)論林氏扇頭蜱抗菌肽Microplusin-like蛋白具有抗革蘭陰性菌活性，初步分析抗菌機制為破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，為開發(fā)蜱的新防治策略、新型抗生素替代提供了參考依據(jù)。
林氏扇頭蜱（Rhipicephalus linnaei）是我國熱帶地區(qū)常見蜱種之一，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究被鑒定為血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineus）的熱帶譜系，主要寄生于犬類和其他哺乳動物，是多種病原體（如立克次體、巴貝斯蟲）的傳播媒介。抗菌肽在蜱的血細(xì)胞、脂肪體、中腸、卵巢和唾液腺等組織中均有表達(dá)，現(xiàn)已分離的蜱抗菌肽主要為血紅蛋白、防御素、溶菌酶、Microplusin等。Microplusin首次在微小扇頭蜱（Rhipicephalus microplus）的血淋巴中被分離，通過螯合銅離子限制菌的呼吸從而對白色念球菌（Candida albicans）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）等革蘭陽性菌及部分真菌起到抑制作用，但對革蘭陰性菌無效。目前，Microplusin這一名稱專指從微小扇頭蜱中分離鑒定的，在其他蜱類中檢測或分離到的類似蛋白則被命名為Microplusin-like。Microplusin-like是蜱蟲防御系統(tǒng)的重要組分，對多種病原體具有抑制作用，但不同蜱類中的Microplusin-like抗生作用有所不同，該類蛋白可開發(fā)成多種藥物。
本研究基于林氏扇頭蜱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過原核表達(dá)獲得Microplusin-like重組蛋白，進(jìn)一步探究其抗菌功能與機制，為開發(fā)蜱類防控藥物和新型抗菌藥物替代提供新的參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 25922、K88、K99、987P、1515），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 43300、CVCC 1882），雞白痢沙門菌（Salmonella pullorum CVCC 1791）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品資所畜牧研究室饋贈。
1.1.2主要試劑與儀器
總RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，DH5α、Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自深圳康體生物醫(yī)藥科技有限公司，pCold-SUMO質(zhì)粒購自湖南豐暉生物科技有限公司，MHB肉湯培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，MHA瓊脂培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）、多功能微孔板檢測酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、熒光定量儀（美國Roche公司）、掃描電子顯微鏡（日本HITACHI公司）、透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；引物合成和基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.1.3林氏扇頭蜱
林氏扇頭蜱采集自海南某犬舍，于海南大學(xué)生命健康學(xué)院病媒生物學(xué)實驗室進(jìn)行寄生傳代培養(yǎng)，傳代宿主為新西蘭大白兔，培養(yǎng)條件為恒溫培養(yǎng)箱溫度（27±1）℃、相對濕度（90±5）%。
1.2方法
1.2.1 Microplusin-like基因擴增
從NCBI獲取Microplusin-like基因序列（XM_037665332.2），使用Snapgene軟件設(shè)計引物（引物上游序列：5'-ATGAAGGCCGTCTTCGTCT-3'；下游序列：5'-TTAATGGCCGTCACCATGG-3'）。利用Trizol法提取林氏扇頭蜱總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后進(jìn)行PCR擴增。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收純化，后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。
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