不同pH磷酸鹽緩沖液中藥物視頻顯微溶出測度
越來越多的制藥工業(yè)管線中的候選藥物表現(xiàn)出較差的水溶性，大多數(shù)已上市的口服速釋制劑幾乎不溶解。這些藥物通常生物利用度低且不一致，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中被歸類為II類和IV類（低溶解度）藥物。為了對新化學(xué)實體(NCE)進(jìn)行分類和表征，需要有效的溶解速率早期篩選方法，該方法可以使用少量材料進(jìn)行。在過去幾年中，人們對早期NCE開發(fā)中的高通量方法（可以同時評估多個條件和樣品）的興趣急劇增加。由于實驗室自動化技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在可以以最少的材料要求篩選大型化學(xué)和配方空間。制藥行業(yè)在高通量實驗的實施和開發(fā)研究制劑前條件的系統(tǒng)方法方面投入了大量資金。使用原位成像技術(shù)，可以實時監(jiān)測溶解過程以及與起始材料不同形態(tài)的其他不溶性沉淀物的形成。該技術(shù)還可以更好地理解藥物顆粒在溶液中的行為，而不是通過單獨評估顆粒大小和形態(tài)進(jìn)行批量測量。研究在非常小的樣品體積中溶解的方法可能是視頻顯微鏡設(shè)置，例如oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)（BioSense）。對標(biāo)準(zhǔn)曲線和紫外吸收行為知識的需求被溶解顆粒顯微照片的圖像分析所取代，因為測量的是觀察到的二維(2D)顆粒面積的減少而不是特定的藥物濃度。這種視頻顯微裝置能夠獲取藥物顆粒隨時間溶解的高分辨率圖像，并且之前已被用于研究過飽和系統(tǒng)中的微生物生長和沉淀。
本研究的目的是開發(fā)一種微克級視頻顯微方法來預(yù)篩選和估計水溶性差的藥物的溶出度。該方法用于研究6種水溶性差的藥物（卡維地洛、地西泮、雙嘧達(dá)莫、非洛地平、非諾貝特和消炎痛）在禁食狀態(tài)模擬腸液(FaSSIF)中、消炎痛在不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶出度，以及在定制的生物相關(guān)介質(zhì)中使用地西泮和雙嘧達(dá)莫。選擇這些藥物來代表早期藥物開發(fā)過程中感興趣的微水溶性候選藥物。另一個目的是評估藥物顆粒溶解時的形態(tài)，確定它們的粒度分布，并跟蹤卡馬西平在磷酸鹽緩沖液中的固態(tài)轉(zhuǎn)化跡象。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
使用oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)（BioSense）進(jìn)行藥物的視頻顯微溶出測試。該設(shè)備以設(shè)定的時間間隔獲取圖像以生成延時視頻，使用6-96孔微量滴定板作為樣品容器，顯微鏡單元帶有連接到機械臂的攝像頭和照明源，用于獲取樣品內(nèi)容的圖像井。1.3μm顯微鏡的光學(xué)分辨率允許檢測0.5μm和1 mm之間的微型物體，使其適用于藥物顆粒、微粉化顆粒和新結(jié)晶顆粒的顯微鏡檢查，因為這些通常適合可觀察的尺寸區(qū)間。oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)具有4倍光學(xué)放大倍率，可在2分鐘和36秒內(nèi)掃描完整的96孔板。該設(shè)備通過一組定制的圖像分析算法分析獲得的溶解圖像。圖像分割算法通過結(jié)合使用形態(tài)圖像重建和紋理分析對圖像進(jìn)行二值化來識別圖像中存在的粒子。為了分離連接的粒子，二值化圖像通過結(jié)合二值掩模和灰度圖像的測地線分水嶺變換進(jìn)一步處理和細(xì)化。對于所有已識別的顆粒，顆粒形狀和形態(tài)參數(shù)，例如面積、具有等投影面積(EQPC)的圓的直徑和Feret直徑，均根據(jù)國際ISO 9276-6標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測量。
實驗結(jié)論
在這項研究中證明了視頻顯微溶出測試可用于根據(jù)溶出速率對藥物進(jìn)行分組，以及研究和跟蹤溶出過程中的相變行為和沉淀，而傳統(tǒng)方法通常需要額外的測試。這一發(fā)現(xiàn)突出了使用基于顯微鏡的溶出方法的優(yōu)勢之一，因為在開發(fā)過程的早期描述NCE的溶出行為對于進(jìn)一步的藥物開發(fā)至關(guān)重要。視頻顯微溶出度測試可以使用低至480μg的藥物和4.3 mL的介質(zhì)進(jìn)行24個孔，使其成為早期NCE開發(fā)過程中的有效溶出篩選方法。使用oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的視頻顯微裝置可作為概念證明，在進(jìn)一步開發(fā)后，它可以用作藥物開發(fā)早期階段的調(diào)查篩選工具，并在開發(fā)過程中協(xié)助決策。
圖1、FaSSIF中消炎痛溶出實驗的24個孔中所有粒子的溶出率，作為其各自粒子面積的函數(shù)。
圖2、a）顯示消炎痛顆粒的視頻顯微溶出測試的原始輸出圖像。b）圖像分析算法識別的消炎痛顆粒，如藍(lán)色邊界框所示，以及由紅色輪廓可視化的暴露表面。c）來自單個顆粒的消炎痛溶出數(shù)據(jù)的線性回歸，顯示溶出速率為10.11μm2 min-1。R2=0.988
圖3、在pH 6.5的FaSSIF中卡馬西平顆粒的30分鐘延時。b為識別和分析粒子而開發(fā)的算法無法將不透明粒子和透明粒子彼此分開。紅色箭頭表示存在柱狀卡馬西平沉淀；藍(lán)色箭頭表示存在針狀卡馬西平沉淀。
圖4、視頻-顯微溶出度測試數(shù)據(jù)與常規(guī)小規(guī)模溶出度測試數(shù)據(jù)的相關(guān)圖。R 2=0.87，斯皮爾曼的ρ=0.92，p=0.0013。進(jìn)行了單向方差分析統(tǒng)計檢驗。(**):p=0.0012;(****)：p<0.0001。●：地西泮，■：卡維地洛，▲：消炎痛，?：消炎痛pH 6.0，?：消炎痛pH 6.5，○：消炎痛pH 5.5，□：雙嘧達(dá)莫，△：非洛地平，▽：非諾貝特。
圖5、不同濃度膽汁鹽和溶血磷脂對視頻顯微試驗。a）雙嘧達(dá)莫和b）地西泮以及常規(guī)小規(guī)模溶出試驗中c）雙嘧達(dá)莫和d）地西泮溶出度的影響。溶血磷脂(LPL)濃度對e）雙嘧達(dá)莫和f地西泮溶出率的影響。左側(cè)y軸(●)為視頻顯微溶出測試數(shù)據(jù)，右側(cè)y軸(○)為常規(guī)小規(guī)模溶出測試數(shù)據(jù)。進(jìn)行了單向方差分析統(tǒng)計檢驗。
總結(jié)
本文討論的方法可以在未來開發(fā)有效的抗菌化合物以改善衛(wèi)生和全球食品安全方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。水溶性差是新候選藥物的共同特征，這導(dǎo)致口服生物利用度低或不一致。這引發(fā)了對溶解度和溶出度的材料有效測試的興趣。本論文目的是開發(fā)一種微克級視頻顯微方法（Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)）來篩選水溶性差的藥物的溶出率。該方法應(yīng)用于禁食狀態(tài)模擬腸液(FaSSIF)中的六種藥物（卡維地洛、地西泮、潘生丁、非洛地平、非諾貝特和吲哚美辛）、不同pH緩沖液中的吲哚美辛以及定制培養(yǎng)基中的地西泮和潘生丁。另一個目的是跟蹤FaSSIF中卡馬西平的相變。通過使用光學(xué)視頻顯微鏡（Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)）隨時間跟蹤顆粒表面積來研究藥物的溶出速率和顆粒行為。一種設(shè)計視頻顯微溶出方法的方法是使用96孔微量滴定板作為樣品容器，如在oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)中，該方法可以同時運行多個實驗，樣品體積很小。當(dāng)使用96孔微量滴定板進(jìn)行溶出實驗時，所使用的介質(zhì)體積和藥物質(zhì)量會大大降低。將顯微鏡連接到機械臂上，所有重復(fù)均以一致的方式自動執(zhí)行溶出數(shù)據(jù)采集。與視頻顯微鏡設(shè)置一樣，應(yīng)用微型紫外光譜溶解產(chǎn)生了類似的溶解速率和pH效應(yīng)分組。使用定制介質(zhì)表明溶血磷脂提高了地西泮和雙嘧達(dá)莫的溶出速率。視頻顯微鏡設(shè)置允許隨著時間的推移跟蹤溶解的卡馬西平顆粒上透明顆粒的成核。開發(fā)的設(shè)置提供了一種材料有效的篩選方法，可根據(jù)溶出率對藥物進(jìn)行分組，其中使用光學(xué)顯微鏡有助于實現(xiàn)高樣品通量。使用定制介質(zhì)表明溶血磷脂提高了地西泮和雙嘧達(dá)莫的溶出速率。視頻顯微鏡設(shè)置允許隨著時間的推移跟蹤溶解的卡馬西平顆粒上透明顆粒的成核。開發(fā)的設(shè)置提供了一種材料有效的篩選方法，可根據(jù)溶出率對藥物進(jìn)行分組，其中使用光學(xué)顯微鏡有助于實現(xiàn)高樣品通量。使用定制介質(zhì)表明溶血磷脂提高了地西泮和雙嘧達(dá)莫的溶出速率。視頻顯微鏡設(shè)置允許隨著時間的推移跟蹤溶解的卡馬西平顆粒上透明顆粒的成核。開發(fā)的設(shè)置提供了一種材料有效的篩選方法，可根據(jù)溶出率對藥物進(jìn)行分組，其中使用光學(xué)顯微鏡有助于實現(xiàn)高樣品通量。