硒化銅納米晶體的制備與殺菌性能試驗
細菌是所有生物中數量最多的一類，它是最為常見的一種病原體，可引起許多嚴重疾病的爆發[1-2]，如肺結核、淋病、梅毒、鼠疫等。抗菌材料是指通過一定工藝，將抗菌劑添加到基體材料中制備成的具有殺滅和抑制微生物生長的一類新型功能材料[3]，該材料在醫療衛生、家庭用品、家用電器、食品包裝等領域有極其廣闊的應用前景。在人們對環境衛生要求日益提高的今天，抗菌材料的應用受到更加廣泛的關注。
圖1 Cu2-xSe NCs抗菌活性示意圖
對病原微生物有殺死或抑制生長作用的抗菌劑是抗菌材料的核心部分，它可分為無機抗菌劑、有機抗菌劑和天然抗菌劑[4]。其中，無機抗菌劑一般利用銀、銅、鋅等金屬自身的抗菌能力而制成抗菌劑[5]，其耐熱性較好且抗菌廣譜；有機抗菌劑主要為香草醛或乙基香草醛類化合物[6]，但耐熱性較差，容易水解，且有效期短；天然抗菌劑主要來源于天然植物的提取，這也導致其數量較少且不能廣譜抗菌。納米技術的快速發展提供了用納米材料控制病原微生物的可能和機會，由于其具有獨特的化學和物理性質，現今已成為新型抗菌劑[7-8]。與銀相比，銅的價格更低廉，且對各種細菌菌株具有優異的抗菌活性，因此銅基納米材料越來越受歡迎。革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌對銅基納米顆粒特別敏感，因此可用于治療燒傷、手術傷口和糖尿病足潰瘍感染[9]。作為抗菌劑，硫屬銅化物擁有耐熱性好、毒性低的優點，且可廣譜持續抗菌[10]。基于硫屬銅化物的這些特點，本實驗利用硫屬銅化物的重要代表之一的硒化銅納米晶體(Cu2-xSe NCs)進行廣譜抗菌。我們以常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aurues(革蘭氏陽性菌)為模型菌株(圖1)，通過測定細菌存活率、細菌生長曲線和殺菌曲線，納米材料的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，以及殺菌動力學來評價Cu2-xSe NCs的抗菌性能。實驗結果顯示，Cu2-xSe NCs對大腸桿菌及其耐藥菌株的MIC均為32μg/mL，而對金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株的MIC則為4μg/mL，這是由于大腸桿菌具有雙層膜而金黃色葡萄球菌僅有單層膜。此外，僅需32μg/mL Cu2-xSe NCs就可在1 h內殺死所有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，證明了Cu2-xSe NCs擁有良好的抗菌性能。
1實驗部分
1.1實驗儀器
細菌實驗使用的所有玻璃器皿、試劑和材料均用LDZX-40SBI蒸汽壓力滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)進行高溫滅菌；所有細菌實驗均在SW-CJ-IF(蘇凈集團安泰公司)潔凈工作臺上進行；細菌培養均在型號為QYC211 INCUBATOR SHAKER的全溫空氣搖床(上海福瑪實驗設備有限公司)中進行；Biotek多功能酶標儀Synergy H1(美國)用于測定細菌的OD600；實驗所用細菌菌種均在-80℃的冰箱中保存，接種和純化后的細菌均在0℃的冰箱中保存。
1.2實驗試劑及材料
合成Cu2-xSe NCs所用的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和CuSO4·5H2O(99%)從國藥化學試劑(上海)有限公司購買。SeO2(99.9%)購自阿拉丁化學(上海)有限公司。維生素C(VC)購自Alfa Aesar Co.Ltd(美國)。配制細菌Luria-Bertani(LB)培養基所用酵母提取物來自拜爾迪生物(OXOID)公司，蛋白胨來自北京奧博星生物技術有限公司，NaCl(分析純)來自成都市科龍化工試劑廠，瓊脂粉來自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。實驗中其他溶劑均為分析純，水為超純水(18.2 MΩ·cm)。
實驗菌種大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli,ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus,ATCC 25923)、大腸桿菌耐藥菌(L339)、金黃色葡萄球菌耐藥株(L393)均由西南醫院檢驗科提供。
1.3硒化銅納米晶體的制備
本文采用溫和的室溫水相法合成Cu2-xSe NCs。具體方法參照Lie等的合成原理[11]并略有改進。將800μL 30 mmol/L CTAB和2.4 mL H2O加入圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下，依次加入50μL 0.2 mol/L SeO2和300μL 0.2 mol/L VC。反應10 min后，加入50μL 0.4 mol/L CuSO4·5H2O和400μL 0.2 mol/L VC。劇烈攪拌混合溶液，在30℃下反應1.5 h，并將混合溶液用10 kDa透析袋透析純化24 h以去除小分子，然后再離心去除大分子。將合成的等離子體Cu2-xSe NCs儲存在4℃冰箱，待用。
1.4培養基的配制
按照每1 L培養液中含5 g酵母提取液、10 g蛋白胨、10 g NaCl、15 g瓊脂的比例配制LB固體培養基，并按照每200 mL培養液中含1 g酵母提取液、2 g蛋白胨、2 g NaCl的比例配制LB液體培養基。將制備的培養基放入錐形瓶中，搖晃均勻，并配制50 mL含0.9%NaCl溶液備用。將抑菌實驗使用的培養皿、試管(試管上端用棉花堵住)、移液槍槍頭、EP管(微量離心管)，以及加入培養液的錐形瓶、加入NaCl溶液的廣口瓶、接純水的廣口瓶用報紙包好，在高溫滅菌鍋中于120℃滅菌30 min。待滅菌鍋降溫至60℃左右時取出所有物品，并輕輕搖晃錐形瓶中的培養液使其混合均勻，待沒有氣泡后將其倒入培養皿中使其自然冷卻凝固，用保鮮膜包裹后放入4℃的冰箱中待用。上述過程均在無菌操作臺上進行，且無菌操作臺必須提前打開紫外燈殺菌30 min，傾倒培養液和自然冷卻的過程需一直通風確保沒有雜菌。
1.5標準菌株細菌懸液的配制
于-80℃冰箱中取出標準菌株，將接菌環置于酒精燈上直至燒紅，冷卻后用接菌環沾取菌液在培養基上輕輕平行地畫線，梯度稀釋三次。將畫好線的培養基置于全溫空氣搖床中進行細菌的一代活化，時間為12 h。取出一代活化的細菌，重復接菌的步驟，挑取單菌落，將其放入全溫空氣搖床，在37℃下孵育12 h進行細菌的二代活化。測其OD值，當OD在0.6～0.8，表明細菌處于旺盛生長的對數生長期。
向試管中加入1 mL 0.9%NaCl溶液，將接菌環置于酒精燈上直至燒紅，冷卻后用接菌環挑取單菌落，并將其放入試管中，讓細菌分散于NaCl溶液中，此時溶液將變得渾濁。采用BaSO4比濁法，制得濃度為1.0×108CFU/mL(CFU：菌落形成單位)的細菌懸液。以下抑菌實驗所用的細菌懸液均在此基礎上稀釋了100倍，即細菌懸液的濃度均為1.0×106CFU/mL。以上步驟均在無菌操作臺上進行。
1.6細菌存活率的測定
取100μL濃度為1.0×106CFU/mL的細菌懸液，100μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液和800μL LB液體培養基加入已滅菌的試管，混合均勻后放入恒溫搖床，在37℃、120 r/min下孵育24 h。用酶標儀測其OD600值并計算細菌的存活率。
1.7最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定
最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)是描述藥物抗菌活性的主要定量參數，也是衡量抗菌試劑抑菌能力的重要指標。在本文中，我們使用液體培養基稀釋法測定MIC和MBC。取一系列EP管并寫上編號，采用二倍稀釋法，依次加入100μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液，再加入100μL 1.0×106CFU/mL細菌懸液和800μL LB液體培養基，混勻后置于37℃全溫搖床孵育24 h。取出試管，觀察各EP管的渾濁程度，第一個澄清透明的EP管所對應的濃度即為MIC。
將所有未生長細菌試管及MIC的前一個試管中的培養液取200μL轉移到干凈的固體LB培養基上，涂板并在37℃全溫搖床中孵育12 h，觀察細菌生長情況。如果培養基上有菌落出現，則說明該濃度只能抑制細菌生長而不能殺死細菌，若無菌落或只有少量菌落(小于5)出現則表明該濃度有殺菌效果。第一個無細菌生長的板所對應的濃度即為MBC。
1.8細菌生長曲線的測定
取一塊96孔板進行該實驗，向每孔中加入100μL溶液，該溶液為1.0×106CFU/mL細菌懸液和Cu2-xSe NCs的混合溶液。其中，對于E.coli，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、2、4、8、16、32μg/mL；對于S.aureus，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5、1、2、4、8μg/mL。每個濃度做3個平行樣，第4個孔為調零孔，該孔溶液為只含有相應濃度Cu2-xSe NCs的LB液體培養基，即為菌液存在。加好樣后將其置于37℃恒溫箱中孵育，并分別于0、1、2、4、6、8、12、16 h取出，搖勻后用酶標儀測定OD600。去除底物吸光度后，以孵育時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制細菌的生長曲線。
1.9時間-殺菌曲線的測定
取100μL濃度為1.0×106CFU/mL的細菌懸液，100μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液和800μL LB液體培養基加入已滅菌的試管。其中，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC，即對于E.coli，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、16、32、64、128、256μg/mL；而對于S.aureus，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、2、4、8、16、32μg/mL。每個濃度做3個平行樣。加好樣后將其置于37℃恒溫箱中孵育，并分別于0、1、2、4、8、12 h取出，涂板后繼續置于37℃恒溫箱中孵育12 h，計算菌落數。以時間為橫坐標，菌落數為縱坐標，繪制時間-殺菌曲線。
1.10硒化銅納米晶體中銅離子的釋放
取一定量的Cu2-xSe NCs裝入10 kDa透析袋中，并將其放入500 mL超純水中，在室溫下攪拌透析。分別于1、2、4、6、8、12、24 h用原子吸收光譜儀測定透析袋外液中Cu2+的濃度并繪制Cu2+釋放曲線。