野生黑木耳N56菌株分離純化、菌絲生長速率實驗（一）
從黑龍江東部山區(qū)的柞櫟木上分離純化采集到61株黑木耳野生菌株，按照常規(guī)育種程序，對這些菌株的性狀進行研究比較，結果表明：N56號菌株的纖維素酶活力為4633 U/g，生物學效率為93.7，產量為（42±5）g/袋,菌絲生長速率為5.4 mm/d,其各方面性狀皆優(yōu)于對照菌株（當?shù)仄毡橥茝V使用的）黑微29,可作為產業(yè)化開發(fā)的母種進行推廣。
木耳營養(yǎng)豐富，含蛋白質、脂肪、鈣、碳水化合物、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素，此外含有大量纖維、鉀、鎂和鈉等。美國科學家發(fā)現(xiàn)黑木耳能減低血液凝塊、肝和冠狀動脈硬化，并且能明顯地防止血栓的形成。保持黑木耳穩(wěn)產、維持產品質量的首位關鍵因素是生產菌株的真確性，不同菌株的生物學效率相差很大，產品的形態(tài)特征甚至口感不盡相同。大量菌株的品種退化、老化和不利變異，造成栽培特性和產量的不確定性[1]，一些退化的菌株嚴重損害了生產者的利益，獲得一株優(yōu)質高產的新菌株勢在必行。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1培養(yǎng)基
1.1.1.1母種培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖（PDA）和綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（CPDA），參照文獻[2]配制。
1.1.1.2原種和栽培培養(yǎng)基（w/w）
闊葉樹木屑78%，麥麩20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量（58±2）%。菌袋尺寸17 cm×33 cm，每袋裝干料350 g左右。
1.1.2菌株
供試菌株系從黑龍江省東部山區(qū)呼瑪、伊春、東寧、勃利、柴河、尚志、雞東等32個地點的柞櫟木上野生黑木耳或耳木上分離，純化后保存在鋸木屑中，共61株菌株；對照菌株黑微29（當?shù)貢充N的主要栽培菌種）。
1.2方法
1.2.1菌種分離方法
將自野外收集到的標本,核對原始序號,標本表面用0.1%升汞消毒,無菌水清洗3次～5次,按無菌操作程序進行組織分離。為便于純化接種在直徑Ф90 mmPDA培養(yǎng)皿上，純化后移入試管，同時接入盛有木屑的試管內，作為備份[3]。
1.2.2選育程序
選育工作按常規(guī)育種程序進行，即從收集到的野生菌種資源開始，經(jīng)組織分離、菌種培養(yǎng)、生理性能測定、初篩、復篩、區(qū)別性鑒別等，綜合評價確定入選菌株。
1.2.2.1初篩[4]
將分離到的61株野生黑木耳菌種和對照菌株黑微29分別接種在PDA培養(yǎng)皿上，28℃，一起培養(yǎng)，隔日觀察生長情況。同時分2批進行拮抗試驗。
將保留下來的18株菌株作為原種進行擴大培養(yǎng)。同時配制栽培培基質，嚴格控制含水量和pH，使用15 mm×28 mm耐126℃高溫符合GB 9687-1988《食品包裝用聚乙烯成型衛(wèi)生標準》[4]規(guī)定的聚丙烯塑料袋分裝，高壓滅菌（126℃，1.5 h～2 h），冷卻，次日接種，每個菌株接種10袋，重復3次。接種后按常規(guī)管理，定時觀察、記錄菌絲萌發(fā)、蔓延、原基形成、出耳及環(huán)境溫度、濕度狀況；計算供試菌株的鮮重g/袋、干重g/袋和生物學效率。
1.2.2.2復篩
將初篩中入選的6株菌株進行活化和擴大培養(yǎng)，制成原種，按初篩的方法進行復篩。每組接種30袋，重復3次，在同一條件下栽培，同時做生化測定以確定N56號菌株的真確性。
1.2.2.3栽培試驗
配制袋栽基質,袋栽的基質為闊葉樹雜木鋸屑。其中鋸屑占78%、糠麩20%、石膏1%和石灰1%，基質含水量60%。菌袋尺寸為17 cm×33 cm，每個菌株接種30袋，樣本數(shù)量≥30，符合統(tǒng)計學的大樣本要求，重復3次。接種后按常規(guī)管理，定時觀察和記錄。產品性狀、質量按NY/T749-2003《綠色食品食用菌》[5]進行評價。
1.2.3培養(yǎng)特征觀察
菌絲形態(tài)觀察系將斜面供試菌種中注入適量無菌水，刮下菌苔并搖勻，吸收0.1 mL菌液于裝有PDA培養(yǎng)基的Φ90 cm培養(yǎng)皿上涂布均勻，置于24℃～25℃恒溫箱中，隔日觀察并測量菌絲蔓延速度，記錄生長情況。用Champ Gel全自動凝膠圖像處理系統(tǒng)樣本并計算出菌絲密度[1]。
1.2.4生長特性研究
將N56號菌株和黑微29黑微29分別接種在PDA培養(yǎng)基和栽培培養(yǎng)基上,作3次重復。設置10個培養(yǎng)溫度（6、10、14、18、22、26、30、34、38、40℃），6個初始pH（pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），比較菌絲生長速率。
1.2.5拮抗實驗
將測定菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)3 d～5 d。菌懸液離心（12000r/min），取上清，4℃保存?zhèn)溆?，用瓊脂擴散法[6]，拮抗反應的形態(tài)特征隆起型、溝型、隔離型按GB/T12728《食用菌術語》[7]規(guī)定的定義判定。
1.2.6纖維素酶活力測定
對培養(yǎng)袋定期取樣，每次取樣樣本重量相同，均為20.0 g，加40 mL生理鹽水，迅速封口，在（40±1）℃水浴中提取酶液，過濾，吸取酶液3 mL，用3，5－二硝基水楊法[8]測定菌絲生長階段和出茹階段的纖維素酶活力。
1.2.7多糖的測定
從栽培場地中取代表性的子實體,去雜后精確稱取4.00 g，加少量熱水浸泡2 h。反復用濾紙吸干多余水分，加50 mL蒸餾水，進行高壓浸提（0.1 MPa，121℃）30 min。濾過取清液，用Seveg法去雜質，5倍冰凍乙醇沉淀多糖。用蒽酮比色法在550 nm波長下測定OD值由標準曲線查算還原糖含量[9]。
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