不同碳源、氮源和金屬離子對耐鋅菌株的生長特性的影響（一）
從造紙廠排污口的土壤中分離對鋅具有較強耐受性的菌株HXZ-1。菌株HXZ-1能夠在含鋅離子濃度為50 mg/L的液體培養基中生長良好，能耐受鋅離子的最高濃度為1000 mg/L。結合其生理生化特征和16S rRNA基因系統發育分析，將該菌株鑒定為原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.HXZ-1)。菌株HXZ-1最適培養條件為：鋅離子濃度為50 mg/L、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源。當鋅離子濃度為50 mg/L時，菌株HXZ-1對鋅吸附率最大，為29.1%；當鋅離子濃度為500 mg/L時，培養時間為10 h時，菌株HXZ-1吸附率最大，為18.8%。菌株HXZ-1是一株對鋅有較強抗性和吸附性的細菌，為重金屬污染的微生物修復提供參考。
隨著現代工業的發展，資源開發與利用為國家的建設和發展做出了巨大貢獻的同時，也造成了生態環境的破壞甚至生態失衡，比如采礦、冶金、煉油等重工業產生的污染物。越來越多的重金屬離子通過各種途徑進入土壤和水體環境中，從而對生態環境和人體健康造成了重大影響[1]。
鋅是維持機體正常生長發育、新陳代謝的重要物質，曾被譽為“生命之花”[2]。鋅離子進入環境后，它具有高毒性、難轉化、難遷移和生物富集等特性。其一旦進入環境后不能被生物轉化，將參與食物鏈的循環，最終在人體內富集，破壞人體內正常的生理代謝，危害人體健康[3]。實驗和流行病學調查證實，人體尿樣中含鋅量為1000μg/L以上時，人體處于鋅中毒狀態[4]。
微生物修復技術因其具有處理費用低,對環境影響小、效率高等優點,在治理重金屬污染方面具有廣泛的應用前景。近年來，利用環境中的微生物來修復重金屬離子對生態環境的污染問題逐漸引起人們的重視。如廖佳等從鉛鋅礦區分離篩選出耐鋅菌株AspergillusoryzaeHA，研究了不同試驗條件對菌株生長的影響以及菌株對鋅離子的吸附[5]；樊霆等從某鋅尾砂壩土壤中篩選分離得到一株對鋅具有較強抗性的菌株AspergillusflavusCTB430-1，鋅對該菌株的最低抑菌濃度為800 mg/L[6]；王慧萍等從江西德興銅礦重金屬污染土壤中篩選得到一株菌株Sphingomonassp.DX-T3-03，可以抗25 mmol/L的鋅[7]；李慧芬等從鉛鋅尾礦區與污水灌溉區土壤中篩選到一株抗鋅的菌株StreptomycesciscaucasicusCCNWHX 72-14，對鋅的抗性達到845 mg/L[8]；李進等從湖南資興鉛鋅礦區的尾砂礦礦渣中篩選到菌株VerticilliuminsectorumJ3，在最佳條件下對鋅的去除率為87.7%[9]。因此，從重金屬污染區土壤中分離耐性菌株用于治理重金屬污染，已成為生物修復生態環境的有效途徑[10-12]。
本研究從甘肅省某造紙廠排污口污水處，長期受重金屬污染的土壤中篩選出一株具有抗鋅能力的菌株，通過其生理生化特征和16S rRNA基因系統發育分析鑒定該菌株，通過不同碳源、氮源和金屬離子對其菌株HXZ-1生長影響的研究，探討該菌株的生長特性，為該菌在重金屬污染的微生物修復技術中提供理論依據。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
菌株由本實驗室分離純化所得，樣品采自甘肅省某造紙廠排污口土壤的不同位置，裝塑料袋密封保存，備用。
1.1.2試劑和培養基
分子操作中所用的酶、抗生素均購自大連寶生物工程有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其余試劑為分析純。
LB培養基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 8.0，pH 7.0，固體培養基在上述培養基的基礎上加入15 g/L的瓊脂。
1.1.3儀器與設備
分析天平(FA2104N)、恒溫振蕩培養箱(HZQ-X400)、分光光度計(722 s)購于上海精密科學儀器有限公司；高壓式蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50SII)購于上海博訊實業有限公司醫療設備廠；超凈工作臺(SWCJ-1)購于蘇州凈化設備；離心機(IS-R)購于上海安亭科學儀器廠；Alpha凝膠成像系統(JS-780)購于上海思伯明儀器有限公司。
1.2方法
1.2.1耐鋅菌株的馴化與分離
耐鋅菌株的分離采用梯度壓力馴化法[7]。稱取10 g待測污水樣品，加入100 mL無菌水中，30℃、150 r/min振蕩培養24 h，使細菌充分懸浮。移取1 mL培養液至另一盛有新鮮的5%LB培養基(含100 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振蕩培養5 d；移取l mL培養液至另一盛有新鮮的5%LB培養基(含200 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振蕩培養5 d；培養后依次移入含300、400、500、600、700、800、900和1000 mg/L ZnCl2的5%LB液體培養基中于30℃、150 r/min振蕩培養5 d。吸取適量菌液稀釋涂布于含有500 mg/L ZnCl2的固體LB培養基上，于30℃下培養48 h，挑取長勢良好的單菌落，經連續分離純化后，得到具有鋅抗性的菌株，編號為HXZ-1，將純化的菌培養后于冰箱中保存備用。
1.2.2生理生化特征鑒定
菌株形態觀察、生理生化試驗等參照《常見細菌系統鑒定手冊》[13]《Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology》[14]等進行。
1.2.3 16S rRNA基因PCR擴增及其測序
采用高鹽法提取菌體的染色體總DNA[15]。以菌株的總DNA為模板，使用通用引物來擴增菌株的16S rRNA基因。5′端引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Escherichiacolibases 8～27)，3′端引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.colibases 1507～1492)。50μL的反應體系：10×Buffer 5.0μL，MgCl2(25 mmol/L)4.0μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0μL，引物(1 mmol/L)各1.0μL，DNA模板(50.0 ng/μL)1.0μL，Taq酶(5.0 U/μL)0.5μL，超純水33.5μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環；最后，72℃再延伸10 min。取PCR產物于0.75%的瓊脂糖凝膠上電泳。PCR產物由上海生工生物工程有限公司完成測序。
1.2.4菌株HXZ-1對不同碳源利用試驗
試驗測定的碳源分別為：葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖。在無碳源培養基中分別加入不同碳源使其終濃度為0.5%。將菌株HXZ-1按3%(V/V)的接種量接種到裝有20 mL不同碳源培養基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培養12 h，在600 nm下測吸光值，每個試驗設計3個平行，取平均值。
1.2.5菌株HXZ-1對不同氮源利用試驗
試驗測定的氮源分別為：酵母粉、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨、尿素、亞硝酸鈉、草酸銨。在無氮源培養分別加不同氮源使其終濃度為0.5%，將菌株HXZ-1按3%(V/V)的接種量接種到裝有20 mL不同氮源培養基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培養12 h，在600 nm下測吸光值，每個試驗設計3個平行，取平均值。
1.2.6不同鋅離子濃度對菌株HXZ-1生長的影響
在50 mL三角瓶中分別裝入20 mL LB培養基，于120℃滅菌30 min。在培養基中加入ZnCl2母液，使其終濃度分別為0、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000和1200 mg/L，以1%的接種量分別接入處于對數生長的種子液，設置空白對照(不添加任何金屬離子)，于30℃，150 r/min培養11 h取樣，在600 nm下測吸光值，所有實驗設3個平行，各樣品均設不接菌的空白對照。
1.2.7菌株HXZ-1在不同鋅離子濃度下的吸附試驗[16]
1.2.8菌株HXZ-1在不同培養時間對鋅離子的吸附試驗[17]
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