棉子糖抑制變異鏈球菌生物膜形成機制研究進展（二）
3.棉子糖對S.mutans GTF的影響
分析GTF相關基因的表達水平和葡聚糖產量，以評估棉子糖對S.mutans GTF的影響。如圖4A所示，在1000μM棉子糖處理的S.mutans生物膜細胞中，所有與GTF相關的基因都顯著下調。與對照相比，gtfB、gtfC和gtfD的表達分別下調了69%、74%和38%。與對照組相比，半乳糖還均勻地降低了GTF相關基因的表達40%到43%，而蔗糖則增加了GTF相關基因的表達水平，特別是gtfC和gtfD，分別增加了1.9到5.5倍(見圖S5A和B)。此外，當棉子糖和蔗糖一起使用時，大多數GTF相關基因水平與對照組沒有顯著差異(見圖S5C)。16S rRNA內參基因的表達不受任何處理的顯著影響。
用固體硫酸銨從含有蔗糖的腦心輸液(BHI)培養的S.mutans中提取GTFs，以評價其生產水不溶性葡聚糖的能力。然后將沉淀的GTF與棉子糖(0-1000μM)反應。以蔗糖為底物，用分光光度計測量葡聚糖色強度來估算葡聚糖的產量。當棉子糖濃度低于10μM時，S.mutans的葡聚糖產量沒有顯著變化(圖4B)。然而，在100-1000μM棉子糖處理后，葡聚糖產量下降了18%-39%，并呈濃度依賴關系。這些結果表明，棉子糖影響了GTF相關基因的表達，并降低了S.mutans葡聚糖的產量(圖5)。
S.mutans分泌的GTFs吸附在細胞膜和細菌表面。吸附的GTF與蔗糖衍生的葡聚糖結合。葡聚糖為S.mutans提供表面結合部位，介導對牙釉質的黏附和緊密的細菌聚集，最終促進生物膜的形成。然而，如果用棉子糖處理S.mutans生物膜，那么棉子糖有望阻止蔗糖衍生的葡聚糖與GTF結合。因此，S.mutans產生葡聚糖的活性降低，這可能會延緩生物膜的形成。
4.棉子糖在人工唾液包被HA爬片上的應用
使用人工唾液涂層的HA爬片來模擬人類口腔環境的條件。通過對S.mutans在HA平板上生物膜細胞的染色和計數來評價S.mutans的粘附性。如圖6A所示，經1000μM棉子糖處理的HA爬片上的S.mutans生物膜細胞與對照相比染色不佳，這表明棉子糖處理后S.mutans細胞難以附著在HA爬片上。菌落計數法也觀察到了類似的結果，在棉子糖處理后，HA爬片上的菌落數量減少(圖6B)。
圖6棉子糖(1000μM)處理后，S.mutans與涂有人工唾液的HA爬片的粘附性
(A)用CV染色評價細菌粘附性。在靜態條件下，將S.mutans生物膜在HA爬片上形成24 h，并對其進行OD545檢測。(B)用細胞計數法評價細菌粘附性。用標準平板培養法計算在HA爬片上形成的分離生物膜細胞的集落數。
此外，還通過掃描電子顯微鏡觀察了棉子糖對S.mutans在HA爬片上生物膜形成的影響。涂布人工唾液和未涂布人工唾液的HA爬片在掃描電子顯微鏡下的圖像沒有差別(圖7A和B)。圖7C和圖7D顯示了S.mutans生物膜在HA爬片上形成的掃描電子顯微鏡圖像。與對照組相比，1000μM棉子糖處理后生物膜的形成顯著減少。半乳糖也對生物膜的形成有不利影響，而蔗糖則增加了生物膜的形成(見圖S6)。這一發現表明，在與人類口腔環境相似的條件下，棉子糖可以有效地控制S.mutans生物被膜的形成。然而，這些結果并不能可靠地表明棉子糖在治療齲齒方面的適用性。為了用棉子糖預防或治療齲齒，還需要進行進一步的研究，包括臨床演示和開發有效的棉子糖應用方法。
圖7棉子糖處理(1000μM)后的S.mutans生物膜在人工唾液涂層HA爬片上的掃描電子顯微鏡圖像。
(A)HA圓盤。(B)涂有人工唾液的透明質酸圓盤。(C)人工唾液涂層透明質酸圓盤上的S.mutans生物膜細胞。(D)人造唾液涂層HA爬片上經棉子糖處理的S.mutans生物膜細胞。
圖S6經1000μM蔗糖和半乳糖處理后，在人工唾液包裹的HA圓盤上S.mutans生物被膜的掃描電子顯微鏡圖像。
(A)涂有人工唾液的透明質酸圓盤。(B)人工唾液涂層透明質酸圓盤上的S.mutans生物膜。(C)人工唾液涂層透明質酸圓盤上經蔗糖處理的S.mutans生物膜。(D)經半乳糖處理的S.mutans在人工唾液涂層的透明質酸圓盤上的生物膜。
討論
在這項研究中，我們發現棉子糖可減少人類致齲菌形成的生物膜，其中棉子糖抑制S.mutans生物膜形成效果比S.sobrinus更有效(圖1)。S.mutans通過生產GTFs，以蔗糖為唯一底物合成粘性、水不溶/可溶性胞外葡聚糖，有助于增加細菌細胞表面的疏水性和生物膜的形成。RT-qPCR結果顯示，棉子糖主要下調S.mutans中gtfB和gtfC的表達(圖4A)。然而，經棉子糖處理后，gtfD表達略有下降。接著，不溶性葡聚糖的產量隨棉子糖濃度的增加而下降(圖4B)。
由于在齲齒患者的整個唾液中檢測到大量的GTF，所以在本研究中，我們使用了唾液涂層的HA（牙釉質的主要成分）。S.mutans分泌的GtfC通常被結合到細胞膜中，表面吸附的GtfC會利用蔗糖生產葡聚糖。在我們的研究中，棉子糖處理降低了葡聚糖的產生，S.mutans進而難以粘附到唾液涂層的HA爬片，最終抑制HA爬片上生物膜的形成(圖5)。
在棉子糖和蔗糖共培養的S.mutans中，蔗糖消耗和生物膜形成減少(圖3A)，這表明棉子糖可能控制了S.mutans中GTF活性。這可能與棉子糖與GtfC結合的可能性有關(圖3C)。棉子糖中的半乳糖與關鍵氨基酸殘基Asp593以及亞基1位點的氨基酸殘基有額外的相互作用，這可能會增強其與葡聚糖酶的結合親和力。此外，在S.mutans中，半乳糖對生物膜形成和GTF基因表達的抑制活性與棉子糖類似，而蔗糖則相反(圖S1B和圖S5)。然而，這些結果并不能提供棉子糖與GtfC結合的直接證據，還需進一步的研究需要闡明棉子糖影響S.mutans GTF活性的具體機制。
Nagasawa等人報道了棉子糖在低濃度的蔗糖中誘導S.mutans生物膜的形成，這與我們的發現相反。盡管兩項研究中生物膜形成的差異可能有很多原因，但我們謹慎認為這種差異與棉子糖濃度有關。這可以解釋為，在高蔗糖水平下，棉子糖不足以抑制生物膜的形成，但這并不會降低棉子糖的活性。相反，0.03%以上的棉子糖處理會促進S.mutans生物膜的形成。這種差異被認為是由于用于抑制S.mutans生物膜形成的剩余棉子糖造成的。棉子糖可以作為鏈球菌中果糖基轉移酶的底物，但GTF不能利用棉子糖。因此，在應用棉子糖調控S.mutans生物膜形成時，應考慮確定適合環境條件的棉子糖濃度。
棉子糖作為一種在天然產物中被發現的低聚糖，可以大大減少S.mutans在靜態和流動條件下的生物膜形成。此外，經1000μM處理后，GTF相關基因表達量和葡聚糖產量降低。并且，經棉子糖處理后，細菌粘附減少，這減緩了在唾液涂層HA爬片上S.mutans生物膜的形成。因此，棉子糖作為一種天然物質在口腔環境中具有防治S.mutans生物膜的潛力。
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