10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（三）
3、討論
A.ferrooxidans BYM在好氧條件下能夠以培養(yǎng)基中的FeSO4為底物進行磁小體合成。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)這類細菌在一定程度上能夠吸收特定有機物轉化為細胞的生長物質(zhì)，但是其同化能力有限[14]。研究發(fā)現(xiàn)，A.ferrooxidans BYM生長和磁小體合成受到培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的影響[28]。由于不同有機物可以調(diào)節(jié)亞鐵轉運，改變細胞膜通透性，從而達到促進A.ferrooxidans BYM生長的目的。因此，本研究以A.ferrooxidans BYM為目的菌株，分別添加10種不同濃度有機物，根據(jù)亞鐵氧化速率判斷不同濃度有機物對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化的效果，為進一步探究A.ferrooxidans BYM磁小體的發(fā)酵奠定基礎。
研究表明，不同濃度的檸檬酸可能影響A.ferrooxidans磁小體相關基因mpsA、feoB、tonB及mpsA的表達，推測其原因可能是由于檸檬酸能夠螯合Fe3+，促進A.ferrooxidans對Fe3+的轉運[29]。對A.ferrooxidans R2進行低分子量有機酸耐受試驗，結果表明A.ferrooxidans R2可以耐受40 mmol/L的檸檬酸[30]。因此，本研究選擇檸檬酸探究其對A.ferrooxidans BYM菌體生長的影響。酒石酸作為常見的金屬螯合劑常用于重金屬吸附，能夠較好地吸附被污染土壤中的鎳、銅、鋅、鎘和鉛[31]。0.5 mmol/L抗壞血酸能夠完全抑制A.ferrooxidans NCIM 5370中的過氧化氫酶活性[32]。其還原作用能夠減少Fe3+的積累，加速鐵的循環(huán)。因此推測，試驗中添加l-抗壞血酸能夠通過還原作用消耗A.ferrooxidans BYM代謝產(chǎn)生的Fe3+，同時減少活性氧和自由基對A.ferrooxidans BYM的損傷。蘋果酸作為一種小分子量有機酸常用于金屬生物浸出[33]。因此，本研究添加蘋果酸，判斷其對A.ferrooxidansBYM菌體生長的影響。在培養(yǎng)基中添加l-甘氨酸能夠促進A.ferrooxidans CK浸出膠磷礦的效率，通過試驗結果可知，l-甘氨酸的存在能夠顯著增強細菌在礦物表面的吸附作用[34]。葡萄糖酸作為鐵螯合劑能夠在一定程度上促進A.ferrooxidans ATCC 23270生長[35]。因此，本研究通過添加葡萄糖酸驗證其對亞鐵氧化的作用。10 mmol/L的吐溫-80能夠促進A.ferrooxidans ATCC 23270生長以及S0和CuFeS2的代謝，其能夠改變A.ferrooxidans細胞表面多聚物[36]。Jafari等報道，10 mmol/L SDS會影響A.ferrooxidansATCC 23270生長，引起細胞膜損傷和礦物表面親水性變化，抑制A.ferrooxidans亞鐵氧化，降低銅浸出率[37]。由于SDS對A.ferrooxidans的強抑制作用，即使將SDS濃度降低至0.001 mmol/L，其仍能夠抑制A.ferrooxidans BYM生長。在搖瓶試驗中，通過添加30 mmol/L TritonX-100在A.ferrooxidans XZ11浸取黃銅礦的體系中，培養(yǎng)24 d，結果表明銅的生物浸出率相較于未添加有機物組提升了42.21%[38]。0.04 mmol/L EDTA處理A.ferrooxidans 1 h后，能夠去除表面脂多糖，對細胞形態(tài)和活性均未產(chǎn)生影響[39]。
結果表明(圖4)，有機酸中l(wèi)-抗壞血酸和蘋果酸對A.ferrooxidans BYM生長具有促進作用。抗壞血酸作為微量元素可以參與生物體的代謝過程，作為小分子抗氧化劑可以中和細胞代謝產(chǎn)生的活性氧和自由基對機體造成的損傷[40]。抗壞血酸作為輔酶因子為羥化酶和單加氧酶等15種哺乳動物內(nèi)酶提供電子，參與了肉堿、膠原蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)合成等過程[41]。因此，可推測試驗中添加l-抗壞血酸能夠通過還原作用消耗A.ferrooxidansBYM代謝產(chǎn)生的Fe3+。檸檬酸的添加不能促進A.ferrooxidans BYM生長。蘋果酸作為三羧酸循環(huán)中的一環(huán)，其在某種程度上促進了菌體的代謝，從而對亞鐵氧化產(chǎn)生了促進作用。本研究通過添加0?30 mmol/L蘋果酸，明確了5 mmol/L的蘋果酸能夠促進A.ferrooxidans BYM生長。葡萄糖酸能夠螯合培養(yǎng)基中的鐵離子，從而促進A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化速率。吐溫-80、TritonX-100以及SDS對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化均起到了抑制作用，這可能是由于以上3種表面活性劑改變了A.ferrooxidans BYM細胞表面張力，抑制了A.ferrooxidans BYM生長，從而導致亞鐵氧化速率降低。本研究選擇EDTA-2Na的原因是其相較于EDTA在酸性條件下更容易溶解，因此選擇EDTA-2Na作為外源有機物進行試驗。結果分析表明，EDTA-2Na不能促進A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化，并且隨著EDTA-2Na濃度升高，可能會螯合培養(yǎng)基中的鐵離子，抑制A.ferrooxidansBYM生長。
向M.magneticum AMB-1培養(yǎng)體系中添加EDTA、羅丹明B、抗壞血酸、赤蘚紅、鄰氨基苯甲酸、檸檬酸、3-(N-嗎啉)丙磺酸、3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸、鈣黃素、葡聚糖、阿侖膦酸、奈立膦酸和煙酰胺等鐵螯合劑可以促進菌株生長并提高磁小體產(chǎn)量；我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，葡萄糖酸可以有效促進A.ferrooxidans的生長并促進菌體合成磁小體[42]。一些有機物可以使細菌的表面變得更為光滑，并使菌體表面的官能團變化[43]。這與本研究SEM及FTIR獲得的經(jīng)葡萄糖酸處理后A.ferrooxidans BYM表面變得光滑(圖6A、6B)、表面官能團發(fā)生變化的結果一致(圖7)。對于趨磁的磁小體合成細菌M.magneticum AMB-1而言，有機物可以通過增加磁小體鏈的長度來提高其單個細胞的磁小體數(shù)量[42]，盡管非趨磁性的A.ferrooxidans BYM不存在磁小體鏈，但葡萄糖酸作用后菌體內(nèi)的磁小體數(shù)量仍然增加，原因可能是葡萄糖酸促進了菌體對鐵的吸收，具體機制仍需要進一步研究。
微生物發(fā)酵動力學能夠探究A.ferrooxidans BYM在整個發(fā)酵過程中的菌體變化、磁小體生成和亞鐵消耗情況，此過程為磁小體的規(guī)模化發(fā)酵提供理論和實踐依據(jù)。發(fā)酵動力學作為描述發(fā)酵過程微生物生長、產(chǎn)物生成和底物消耗的學科，能夠在發(fā)酵過程中通過模型建立實現(xiàn)發(fā)酵的動態(tài)監(jiān)控，以達到高效生產(chǎn)。目前，發(fā)酵動力學主要分為菌體生長動力學、產(chǎn)物生成動力學和底物消耗動力學。Logistic方程作為經(jīng)典菌體生長動力學模型，廣泛用于微生物的發(fā)酵研究，Logistic方程描述了三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素過程中菌體生長情況，并很好地描述了菌體生長的動態(tài)情況[44]。Logistic方程對于嗜酸乳桿菌的菌體發(fā)酵進行描述，并對其在48 h內(nèi)菌體生長進行分析[21]。對拉曼HLY0902進行搖瓶發(fā)酵動力學研究，利用Logistic方程建立了菌體生長動力學模型[20]。產(chǎn)物生成動力學是描述產(chǎn)物生成與菌體生長之間的關系的科學，通過對產(chǎn)物生成動力學的探究，可以明確單一發(fā)酵和復合發(fā)酵的不同機制。底物消耗動力學一般與細胞生長、產(chǎn)物生成和維持底物消耗的能量3種因素相關。通過描述發(fā)酵動力學，能夠?qū)w生長、目標產(chǎn)物生成、底物消耗過程等階段進行明確調(diào)控，這對于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)具有關鍵性意義。
本文以A.ferrooxidans BYM為目的菌株，探究在10 mmol/L葡萄糖酸下4 L發(fā)酵體系代謝變化。通過分批培養(yǎng)測定A.ferrooxidans BYM的生物量、磁小體生成量和亞鐵氧化速率，明確A.ferrooxidans BYM在各個階段的變化情況。基于經(jīng)典Logistic方程、Luedeking-Priet方程以及發(fā)酵動力學模型成功構建了A.ferrooxidans BYM菌體生長、磁小體合成及亞鐵消耗動力學模型，其擬合度R2分別為0.99、0.98及0.98，數(shù)值均大于0.90，說明模型能夠很好地反映A.ferrooxidans BYM發(fā)酵動力學。通過非線性擬合的方法擬合得到的3個方程與實際值接近，誤差較小，能夠很好地反映A.ferrooxidans BYM在各個階段發(fā)酵變化。3個發(fā)酵模型的建立為今后的發(fā)酵條件控制和磁小體規(guī)模化發(fā)酵提供了一定的理論參考價值。
4、結論
本研究以A.ferrooxidans BYM為研究對象，通過單因素試驗探究10種外源添加有機物對其生長的影響，根據(jù)試驗結果篩選得到對磁小體合成促進效果最明顯的一種有機物。在最優(yōu)促進劑下對A.ferrooxidans BYM在發(fā)酵過程中的菌體生長、磁小體合成以及亞鐵消耗動力學進行研究。通過以上探究過程，本研究得出以下結論：
(1)通過亞鐵氧化速率的測定，篩選出l-抗壞血酸、蘋果酸以及葡萄糖酸對A.ferrooxidans BYM生長具有顯著的促進作用，并確定了合適的濃度范圍。
(2)通過4 L體系發(fā)酵試驗，對3種有機物進行濃度優(yōu)化。獲得最優(yōu)促進劑葡萄糖酸，以10 mmol/L添加時，磁小體產(chǎn)量可達2.00×10?3 g/L。
(3)通過不同時間梯度的分批發(fā)酵試驗，本研究建立了A.ferrooxidans BYM的菌體生長、磁小體生成和亞鐵消耗動力學模型。
研究結果表明在葡萄糖酸的作用下能夠?qū).ferrooxidans BYM發(fā)酵過程進行調(diào)控，改善磁小體發(fā)酵過程，為后續(xù)大體系通過微生物發(fā)酵產(chǎn)磁小體提供理論及實踐依據(jù)。
10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（一）
10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（二）
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