犬奇異變形桿菌及其噬菌體分離鑒定、生長曲線及藥敏試驗（二）
1.2.3細(xì)菌脲酶鑒定
參照W.B.Christensen等的試驗方法，將分離純化的細(xì)菌接種于尿素培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)10～12 h后，觀察尿素培養(yǎng)基顏色變化。尿素培養(yǎng)基由橘黃色變紅色則表明細(xì)菌能夠產(chǎn)生尿素酶。
1.2.4 16 Sr R NA的擴(kuò)增
參考細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，稀釋至濃度為20 ng·μL-1備用。設(shè)計細(xì)菌16S通用引物，引物序列為F5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′和R5′-GTTACCTTGTTACGACT-3′，預(yù)擴(kuò)增片段大小約為1 500 bp。PCR擴(kuò)增體系（總體積為50μL）：Rnase-free 2×Taq Mix 25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，H2O 19μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性90 s；94℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min。使用DNA純化回收試劑盒切膠純化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶大小無誤后送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果與GenBank中其他序列進(jìn)行比對分析。
1.2.5藥敏試驗
挑取單個菌落置于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6～8 h，取100μL菌液滴入LB固體培養(yǎng)基中涂布均勻，將不同的藥敏紙片置于均勻涂滿菌液的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌環(huán)直徑，參照CLSI（2014）標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。
1.3噬菌體分離鑒定及生物學(xué)特性分析
1.3.1噬菌體的分離純化及電鏡觀察
取未處理污水經(jīng)紗布初濾大顆粒雜質(zhì)后加入CaCl2終濃度為1 mmol·L-1，6 000 g離心15 min除去其他雜質(zhì)。采用透析袋濃縮離心后的污水上清4℃過夜，濃縮后的污水經(jīng)0.22μM濾膜過濾除菌、備用。以分離到的菌液為宿主菌分離噬菌體，將100 mL除菌的濾液上清加入100 mL 2×LB培養(yǎng)基，滴入對數(shù)生長期的宿主菌100μL，37℃160 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，10 000 g離心10 min，將上清經(jīng)0.22μM濾器過濾除菌。將濾液和宿主菌充分混合，接種到融化的半固體培養(yǎng)基（瓊脂含量0.75%）充分混勻，倒入營養(yǎng)瓊脂平板中，凝固后置于37℃恒溫培養(yǎng)8 h，觀察噬菌斑的形成情況。挑取透明、形狀規(guī)則的噬菌斑，采用雙層平板法分離純化8～10次，可以得到純化的噬菌體。
為了進(jìn)一步觀察vB_PmM_XNR的形態(tài)，采用透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。簡要步驟：取噬菌體懸液10μL（106PFU·mL-1）置于銅網(wǎng)，靜置20 min左右，用濾紙吸干多余液體，用負(fù)染液（2%磷鎢酸溶液）染色5 min，濾紙吸干染液后，用蒸餾水清洗2遍，干燥后置于透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。
1.3.2最佳感染復(fù)數(shù)測定及一步生長曲線
將細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（約1×108CFU·mL-1），噬菌體與細(xì)菌各100μL，按照比例為100、10、1、0.1、0.01、0.001進(jìn)行混合，室溫靜置10 min。37℃恒溫160 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 h。雙層平板法測定噬菌斑個數(shù)，以噬菌體滴度增加最高比例的為最佳感染復(fù)數(shù)，重復(fù)3次取均值。
將對數(shù)生長期的分離株（OD600=0.3，約為1×108CFU·mL-1）和噬菌體按MOI等體積（各500μL）混合后，置37℃靜置孵育15 min，8 000 g離心5 min，棄上清。沉淀重懸于10 mL LB中，37℃搖床160 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每間隔5 min取樣，測定不同時間點(diǎn)噬菌體滴度，繪制一步生長曲線。
1.3.3噬菌體溫度和pH穩(wěn)定性實(shí)驗
將等體積噬菌體（108PFU·mL-1）分別置于不同溫度（4、25、37、42、60和70℃）條件下孵育1 h后，采用雙層平板法檢測噬菌體滴度變化，評價噬菌體熱穩(wěn)定性。同樣，將等體積的噬菌體分別加到不同pH（pH=2.0～12.0）的緩沖溶液中37℃水浴中孵育1 h，檢測噬菌體滴度。
1.3.4氯仿敏感性檢測
取1 mL（108PFU·mL-1）噬菌體液加入氯仿（1%體積），充分混合15 s后置于室溫靜置30 min，待分層后取上層溶液測定滴度。
1.4體外裂解作用
將奇異變形桿菌PM-XNR培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PBS（pH=7.4）洗滌去除培養(yǎng)基，并調(diào)整細(xì)菌濃度為108PFU·mL-1，加入1 mL效價約為108PFU·mL-1的噬菌體XNR于37℃靜置培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、24 h測定培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度以及噬菌體效價。
2結(jié)果與分析
2.1革蘭氏染色和生物學(xué)特性檢測
分離株在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形褐色，邊緣圍繞一圈透明帶，符合奇異變形桿菌在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上生長特性，如圖1 A所示。分離株經(jīng)革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察呈紅色，無芽孢及莢膜，具有多形態(tài)性呈桿狀、球狀等（見圖1 B）；透射電鏡能夠清楚看到細(xì)菌形態(tài)，表面粗糙、有鞭毛（見圖1 C）；分離株在血瓊脂培養(yǎng)呈灰白色菌落，具有溶血現(xiàn)象，散發(fā)特殊的腐敗性臭味（見圖1 D）；分離株在尿素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h變?yōu)榉奂t色，說明分離株產(chǎn)生脲酶分解尿素（見圖1 E），這也是泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生結(jié)石的主要原因之一。通過上述革蘭氏染色和生物學(xué)特性實(shí)驗可以初步判定分離株為奇異變形桿菌。
圖1分離菌生物學(xué)特性及電鏡觀察結(jié)果
2.2 16Sr RNA序列同源性比較
細(xì)菌基因組經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在1 500 bp左右出現(xiàn)單一條帶（圖2）。測序后BLAST分析比對，發(fā)現(xiàn)與其Query程度最高的幾種16SrRNA序列均為奇異變形桿菌，其Query程度均高達(dá)98%以上，因此可以確定分離到的菌株為奇異變形桿菌，命名為PMXNR。
圖2 16Sr RNA擴(kuò)增結(jié)果
2.3藥敏試驗
18種藥品對PM-XNR進(jìn)行藥敏試驗，其中該菌株P(guān)M-XNR對頭孢抗生素頭孢吡肟敏感，對阿米卡星、氨芐西林、左氧氟沙星、氯霉素和環(huán)丙沙星中度敏感；對其他使用的抗生素均耐藥。說明犬源奇異變形桿菌具有較強(qiáng)的耐藥性。
表1 PM-XNR藥敏試驗結(jié)果（抑菌圈直徑/mm）
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