莠去津?qū)λ靖H土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)及降解基因豐度的影響（一）
莠去津(atrazine，ATZ)屬于三嗪類芽前、芽后除草劑，在玉米、高粱、甘蔗等作物上廣泛使用，主要防除多種一年生禾本科和闊葉雜草，具有防治效率高、成本低廉、殺草譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在70多個(gè)國(guó)家及地區(qū)應(yīng)用廣泛。與此同時(shí)，由于莠去津遷移性較強(qiáng)且消解半衰期長(zhǎng)，導(dǎo)致其在農(nóng)田土壤、毗鄰農(nóng)田的地下水及地表水中頻頻被檢出，在種植玉米后的土壤中莠去津的檢出量可達(dá)0.9 mg/kg。環(huán)境中殘留的莠去津易被植物吸收，對(duì)后茬敏感作物(水稻、小麥、甘薯等)造成藥害，嚴(yán)重影響后茬作物的生長(zhǎng)及安全生產(chǎn)。據(jù)報(bào)道，按照通常用量(38%莠去津懸浮劑1.5 L/hm2)施用，莠去津?qū)π←湹纳L(zhǎng)影響較大，可造成小麥旗葉干枯、籽粒偏小等現(xiàn)象；采用低濃度莠去津(0.2～0.8 mg/L)處理水稻幼苗后，水稻生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，葉綠素含量下降，同時(shí)莠去津可在水稻籽粒中積累。另外，莠去津還能通過(guò)食物鏈(如谷物等)進(jìn)入人體，對(duì)動(dòng)物及人類的神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)具有潛在的威脅。因此，降低生態(tài)環(huán)境及農(nóng)作物中莠去津的殘留，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類健康具有重要意義。
土壤中微生物無(wú)處不在，其對(duì)土壤物質(zhì)循環(huán)和農(nóng)藥殘留修復(fù)起著重要作用，但殘留農(nóng)藥反過(guò)來(lái)也會(huì)影響土壤微生物的多樣性及功能基因的豐度。同時(shí)，根際微生物也會(huì)影響植物對(duì)農(nóng)藥的降解代謝。研究表明，根際微生物可以聯(lián)合植物提高根際土壤中農(nóng)藥的降解效率，緩解殘留農(nóng)藥對(duì)植物的毒害作用。Ahmad等發(fā)現(xiàn)，將根際降解菌群接種于雙草醚(2和5 mg/L)污染土壤，可以增強(qiáng)小麥對(duì)雙草醚的降解作用，降解率可高達(dá)100%；Salam等發(fā)現(xiàn)，在種植前將甘蔗莖稈浸泡在含假絲酵母菌酵母CandidaVITJzN04(3×105CFU/mL)的YEPD培養(yǎng)基中，處理5 d后種植在林丹(100 mg/kg)污染土壤中，可以顯著增強(qiáng)甘蔗根際林丹的降解，使其降解半衰期從43.3 d減至7.1 d。近年來(lái)，關(guān)于莠去津降解菌的篩選及應(yīng)用有較多報(bào)道，同時(shí)降解菌的降解基因也已明確，包括atzA～atzF，其中模式菌株P(guān)seudomonassp.ADP包含了所有降解基因，能將莠去津完全礦化。然而，目前關(guān)于莠去津降解菌的研究主要集中于離體條件下菌株對(duì)莠去津的降解功能探究，以及菌株在修復(fù)莠去津污染土壤中的應(yīng)用，但關(guān)于莠去津降解菌在“土壤-植物”系統(tǒng)的修復(fù)應(yīng)用報(bào)道較少，菌株對(duì)植物耐受莠去津脅迫的影響機(jī)制也尚不清楚。
本研究采用盆栽試驗(yàn)?zāi)M水稻的大田生長(zhǎng)環(huán)境，研究了莠去津?qū)λ靖H微生物菌群結(jié)構(gòu)及降解基因豐度的影響，并從水稻根際土壤中分離純化出一株莠去津降解菌Pseudomonassp.AT2，將其應(yīng)用于莠去津污染土壤，探究了AT2對(duì)“土壤-水稻”系統(tǒng)中莠去津降解的影響及機(jī)制，以期為保障水稻的安全生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1供試材料
1.1.1藥劑及試劑98%莠去津(atrazine)原藥購(gòu)于先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司，稱取0.02 g(精確到0.0001 g)莠去津原藥，用50 mL乙腈完全溶解，配制成400 mg/L的莠去津母液，于4℃保存，待用；乙腈為色譜純。無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.40 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.20 g，K2HPO40.20 g，(NH4)2SO40.20 g，CaSO40.08 g，去離子水1 L，pH 7.0～7.2，并于121℃滅菌20 min，備用。植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Green qPCR SuperMix購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
1.1.2供試土壤采自江蘇省南京市農(nóng)田(0～20 cm)，土壤類型為黃棕壤(N 35.03°；E 118.87°)，其基本理化性質(zhì)為：pH 7.24，黏粒含量27%，有機(jī)質(zhì)含量為24.61 g/kg，有機(jī)碳含量為7.44 g/kg。土樣去除植物根系后過(guò)2 mm不銹鋼篩網(wǎng)，備用。
1.2根際土壤微生物群落多樣性分析
莠去津污染土壤的制備參照程金金等的方法。取1 mL 400 mg/L的莠去津母液，采用100 mL丙酮稀釋后，均勻添加至500 g供試土壤中并混合均勻，通風(fēng)放置24 h至丙酮揮發(fā)完全，獲得土壤中莠去津終濃度為0.8 mg/kg的污染土壤，該濃度在已報(bào)道的土壤中莠去津的殘留濃度范圍內(nèi)。均勻噴灑去離子水至田間最大持水量的60%，以不添加莠去津的土壤作為空白對(duì)照。將消毒后的水稻種子置于育苗盤中，當(dāng)生長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，選取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的水稻苗移栽至裝有500 g土壤的燒杯中，每個(gè)處理重復(fù)4次。每個(gè)燒杯中添加30 mL無(wú)菌水，每天補(bǔ)充水至初始水平，置于水稻溫室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：200μmol/(m2·s)，14 h光照/10 h黑暗；晝/夜溫度為30/25℃。培養(yǎng)6 d后，參照馮發(fā)運(yùn)等的方法收集每個(gè)燒杯中水稻的根際土壤，得到4個(gè)平行的待測(cè)土壤樣品。利用FastDNA®Spin Kit(MP Biomedical，Solon，OH，美國(guó))提取土壤DNA，并通過(guò)NanoDrop 2000超微量核酸測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳法評(píng)估所提取DNA的樣品質(zhì)量。以合格的土壤DNA樣品為模板，利用特異性引物338F(ACTCCTACGGGA GGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGT WTCTAAT)對(duì)16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進(jìn)行切膠回收，回收的產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，基于Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，并通過(guò)云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
1.3根際土壤中莠去津降解基因豐度測(cè)定
根據(jù)已報(bào)道的莠去津降解基因引物，采用定量PCR儀Bio-Rad CFX96對(duì)土壤中莠去津降解基因進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定其豐度。將降解基因的PCR產(chǎn)物連接至pEASY-T3載體，并驗(yàn)證基因序列。選擇序列正確的質(zhì)粒以10倍梯度稀釋，測(cè)定不同濃度質(zhì)粒的CT值，并換算成拷貝數(shù)，建立莠去津降解基因質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.2節(jié)中提取得到的不同土壤DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各處理樣品中莠去津降解基因的拷貝數(shù)。采用Green qPCR SuperMix進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10μL 2×Mix，0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，1μL DNA模板，8.2μL無(wú)菌水。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30 s，1個(gè)循環(huán)；94℃5 s，55℃15 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)。
1.4莠去津降解菌的篩選及鑒定
取1.2節(jié)中制備的土壤樣品5 g，置于LB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24 h后，依次轉(zhuǎn)移至含莠去津(2、10和50 mg/L)的MSM液體培養(yǎng)基中梯度馴化3次。取馴化培養(yǎng)后的菌液涂布于莠去津終濃度為10 mg/L的MSM固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行多代劃線培養(yǎng)，得到純化菌株。將純化后的單一菌株接種于含10 mg/L莠去津并以其為唯一碳源的MSM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，同時(shí)以不接菌的處理組為對(duì)照，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d后，通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定莠去津含量并計(jì)算降解率。MSM液體培養(yǎng)基中莠去津的提取與檢測(cè)參考李陽(yáng)陽(yáng)等的方法。提取其中具有降解功能菌株的DNA，用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序，利用NCBI比對(duì)測(cè)序結(jié)果并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)合菌株的形態(tài)及生理生化特征，確定降解菌的菌屬。
1.5降解菌對(duì)莠去津脅迫下水稻的影響
試驗(yàn)共設(shè)置4組處理：1)對(duì)照土壤+對(duì)照水稻；2)對(duì)照土壤+接菌水稻；3)含莠去津土壤+對(duì)照水稻；4)含莠去津土壤+接菌水稻，其中莠去津含量均為0.8 mg/kg。選擇降解能力最強(qiáng)的菌株AT2為目標(biāo)菌株，用滅菌后的生理鹽水配制菌懸液至OD600約為1.0。將2份長(zhǎng)勢(shì)一致的三葉一心期水稻苗置于上述菌懸液中浸根處理12 h，得到2份接菌水稻；2份對(duì)照水稻采用等量的無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行相同處理。將處理后的4份水稻分別種植于對(duì)照土壤和莠去津污染土壤中，培養(yǎng)6 d后測(cè)定水稻的相關(guān)生理指標(biāo)、土壤和水稻中莠去津的含量以及水稻中莠去津降解基因的表達(dá)量。土壤和水稻中莠去津的提取與檢測(cè)方法采用Ma等的方法，回收率為89.6%～102.3%，滿足殘留農(nóng)藥檢測(cè)要求。
水稻中莠去津降解基因表達(dá)量的測(cè)定：通過(guò)液氮將植物樣品研磨至粉末，利用植物總RNA提取試劑盒提取RNA，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性和純度，取上述合格的RNA樣品(1.0μg)，經(jīng)gDNA Eraser消除DNA后合成cDNA，并作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)已報(bào)道的水稻中莠去津降解基因設(shè)計(jì)特異性引物，并以O(shè)sActin為內(nèi)參基因。熒光定量PCR體系與反應(yīng)程序同1.3節(jié)。
1.6數(shù)據(jù)分析
通過(guò)Excel 2016和Origin 2021軟件制圖。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；或采用Student’st-test(t檢驗(yàn))進(jìn)行分析。
莠去津?qū)λ靖H土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)及降解基因豐度的影響（一）
莠去津?qū)λ靖H土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)及降解基因豐度的影響（二）
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