大腸桿菌噬菌體Φ199一步生長曲線、與鹽酸克林霉素體外聯合應用效果（一）
摘要：旨在探究大腸桿菌噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素體外聯合應用的效果。對以大腸桿菌O157:H7為宿主菌的噬菌體Φ199的生物學特性進行了研究，并對噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素聯用抗菌效果進行評估。結果：噬菌體Φ199是肌尾噬菌體，其頭部直徑約為50 nm，尾部長度約為100 nm；噬菌體Φ199能夠在40~60℃穩定存活，并且在pH值3~12范圍內保持活性，表明噬菌體Φ199具有較寬的溫度、酸堿耐受性；噬菌體Φ199的最佳感染復數(MOI)為1，一步生長曲線顯示潛伏期為5 min，裂解期為5 min，裂解量為44，能夠在3 h內抑制細菌生長；抗生素聯合應用結果顯示，噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素聯合應用有協同作用，與效價為10^6~10^7 PFU/mL的噬菌體聯用時可將抗生素有效濃度降低至1/2 MIC，在與效價為10^8 PFU/mL的噬菌體聯用時可將抗生素有效濃度降低至1/4 MIC。
大腸桿菌O157:H7是一種重要的食源性致病菌，常通過消化道進入動物體內，定殖并破壞腸黏膜上皮細胞，通過產生志賀毒素引起細胞死亡并進入血液循環，對機體造成損傷。大腸桿菌O157:H7主要傳染源是感染者和無癥狀攜帶者，通常能夠通過受污染的食物和水感染人，引起腹瀉、發熱、嘔吐等癥狀，具有較高的發病率和死亡率，是一種重要的人獸共患病原菌。抗生素是治療大腸桿菌O157:H7感染的主要手段，但是部分研究人員從環境和人體糞便樣本中分離到該菌耐藥菌株，這些耐藥菌株可能限制了抗生素治療的療效。自20世紀80年代，人們就發現對青霉素等抗生素具有耐藥性的大腸桿菌O157:H7菌株。近年來，隨著抗生素的普及，多重耐藥菌也逐漸增多，如今，人們能夠從奶牛等動物體內檢測出具有耐氨芐西林、頭孢菌素、卡那霉素等多種抗生素的多重耐藥大腸桿菌O157:H7菌株，這為該菌感染的進一步防治帶來了挑戰。
噬菌體是一種在自然界中廣泛存在的微生物，作為細菌的天然克星，其具有動態自適應靶向能力、高度的物種特異性、良好的生物相容性以及能夠裂解耐藥細菌等優勢。近年來，噬菌體治療的相關研究取得了一定進展。一項研究表明，用噬菌體處理多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的傷口時表現出高達99%的愈合效率。此外，研究人員通過將3種針對O157:H7大腸桿菌的噬菌體混合成"雞尾酒"治療小鼠腸炎，顯著提高了小鼠存活率以及預后效果。這些試驗都證明了噬菌體治療的可能性。然而，噬菌體和細菌始終處于競爭關系中，細菌可能在短時間內通過修飾受體或其他突變機制逃避噬菌體的感染，獲得對噬菌體的抗性，導致單一的噬菌體無法徹底清除細菌感染。
基于抗生素和噬菌體對細菌不同的殺菌機制，臨床或試驗中嘗試將抗生素和噬菌體聯合治療，與單純抗生素或噬菌體治療相比，可避免細菌對單純抗生素或單純噬菌體產生耐藥性，顯著提高患者的治愈比例，且通過正確的聯合用藥還能夠降低藥物的副作用，提高治療效果。本試驗檢測了大腸桿菌噬菌體Φ199最佳感染復數(MOI)、一步生長曲線等生物學特性，同時也檢測了大腸桿菌O157:H7對不同抗生素的耐藥性，在此基礎上探究了噬菌體與鹽酸克林霉素聯合用藥的效果。
1材料與方法
1.1材料
大腸桿菌O157:H7菌株為江蘇省疾病預防與控制中心惠贈，南京農業大學動物醫學院人獸共患病實驗室保存；噬菌體為實驗室分離保存的肌尾科噬菌體Φ199；Mueller-Hinton(MH)培養基購自海博生物技術有限公司；鹽酸克林霉素購自北京索萊寶科技有限公司。
1.2噬菌體效價測定
采用雙層平板法進行噬菌體增殖。宿主菌O157:H7大腸桿菌培養至對數期，取100μL菌液與100μL噬菌體混合均勻，加入45℃的Luria-Bertani(LB)半固體中，混勻后倒入LB平板。30℃過夜培養，待平板上長滿空斑后取出平板，加入5 mL SM液，4℃放置12 h。最后吸取SM液用0.22μm的濾膜過濾，所得濾液即為噬菌體裂解液，于4℃保存備用。
采用雙層平板法進行噬菌體效價測定。上述噬菌體裂解液用SM液進行10倍倍比稀釋，每個稀釋度取100μL與100μL對數期大腸桿菌O157:H7混勻，加入45℃的LB半固體中，混勻后倒入LB平板。30℃過夜培養，第2天取出平板，計數噬菌斑為30~300之間的平板。重復以上操作3次，取平均數為對應噬菌體的效價。