產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（二）
1.3產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選
吸取10mL水樣至100mL滅菌海水中，180r/min、30℃振蕩10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、靜置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、30℃下培養(yǎng)。2 d后，吸取5 mL富集培養(yǎng)菌液至100 mL新鮮的富集液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行二次富集，如此連續(xù)富集培養(yǎng)3次。吸取1 mL第3次富集培養(yǎng)菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-4；吸取100μL稀釋度為10-4的菌液在羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上涂布，挑選在羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上水解圈較大且在350 nm紫外燈下橙黃色熒光亮斑較大的菌落為篩選分離菌株。挑取菌落繼續(xù)于羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上重復(fù)3次劃線分離培養(yǎng)，直到菌落形態(tài)一致。挑取羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上的單菌落至復(fù)篩固體培養(yǎng)基上重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至單菌落不再染上羅丹明B顯色劑。挑選在復(fù)篩固體培養(yǎng)基上的單菌落至改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于200 r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定篩選得到菌株的產(chǎn)脂肪酶活性，以最優(yōu)產(chǎn)脂肪酶活性的菌株為目的菌株。
1.4菌株鑒定
1.4.1菌落形態(tài)及鏡檢
挑取純化單菌落于計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基上劃線，參照沈萍等的方法進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色（沈萍等，2005）。
1.4.216S rDNA序列測(cè)定和分析
單菌落振蕩培養(yǎng)18 h后，按照北京艾德萊生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒的說明提取目的菌株DNA，對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序（徐先棟等，2012）。
1.4.3生理生化鑒定
挑取純化單菌落，參照東秀珠的方法進(jìn)行VP測(cè)定、丙酸鹽、淀粉水解、明膠水解、V-P培養(yǎng)物終pH>7、檸檬酸鹽、55℃、pH 5.7、pH 6.8、NaCl 5%、NaCl 7%等理化指標(biāo)試驗(yàn)（東秀珠等，2001）。
吸取6 mL目的菌株過夜培養(yǎng)液（于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-12 h）轉(zhuǎn)入盛有60 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基的三角瓶中，混勻后分別吸取5 mL混合液至標(biāo)記0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20的12支無菌大試管中。于30℃、250 r/min條件下培養(yǎng)，并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將標(biāo)有對(duì)應(yīng)時(shí)間的大試管取出，分別吸取1 mL各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)培養(yǎng)菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-5。吸取100μL稀釋度為10-5的菌液于計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基上涂布、計(jì)數(shù)。
1.6脂肪酶活力的測(cè)定
在40℃、pH 7.5條件下，以1 min催化水解反應(yīng)底物（橄欖油）釋放1μmol脂肪酸的酶量定義為1個(gè)脂肪酶活力單位（U）（施巧琴，1998）。搖瓶發(fā)酵48 h后，吸取發(fā)酵上清液于8 000 r/min、4℃下離心5 min，吸取上清酶液備用，參照李建武等的方法測(cè)定所篩菌株的產(chǎn)脂肪酶活（李建武等，1994）
1.7產(chǎn)酶條件的優(yōu)化
改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基瓶裝量為50 mL/250 mL時(shí)，根據(jù)接種量、碳源、pH、溫度、鹽度等影響產(chǎn)脂肪酶的因素，依次進(jìn)行LD-1302產(chǎn)脂肪酶活條件的優(yōu)化。
1.7.1接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響
研究菌起始濃度為5×105CFU/mL的LD-1302的接種量分別為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適溫度接種量。
1.7.2碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響
研究以1%的橄欖油、椰子油、葵花籽油為碳源時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶活性的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適碳源。
1.7.3pH對(duì)產(chǎn)酶的影響
研究改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH分別為5、6、7、8、9時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適pH。
1.7.4溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響
研究改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵溫度分別為27℃、37℃、47℃時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適溫度。
1.7.5鹽度對(duì)產(chǎn)酶的影響
研究海水鹽度分別為28、30、32、34、36時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適鹽度。
1.8采用SPSS
統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，并采Tukey法對(duì)影響酶活的因素進(jìn)行分析比較。
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