?高產纖維素酶枯草芽胞桿菌生長曲線、產蛋白酶及α-淀粉酶能力及藥物敏感性研究（一）
摘要： 旨在篩選潛在高產纖維素酶的益生菌并探究其益生作用以期用于生產實踐。從綿羊腸道內容物中，利用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）平板篩選產纖維素酶菌株，測定其纖維素酶活性，篩選出目標菌株；采用形態學分析、生化試驗和16S rDNA序列分析對目標菌株進行鑒定；進一步探究其生長曲線、產蛋白酶及α-淀粉酶能力、抑制病原菌能力、耐酸耐膽鹽能力、藥物敏感性和宿主安全性。結果：從樣品中篩選獲得8株產纖維素酶菌株，根據透明圈和菌落直徑比值以及纖維素酶活性篩選獲得產纖維素能力最強的菌株ECL1.2，其羧甲基纖維素酶活性為18.61 U/mL，經鑒定為枯草芽胞桿菌；ECL1.2在培養12 h后進入對數生長期，在培養26 h時進入穩定期；其蛋白酶和α-淀粉酶活力分別為2.08 U/mL和19.7 U/mL；可抑制大腸桿菌、腸炎沙門菌和金黃色葡萄球菌的生長；在pH值為2～7培養4 h及膽鹽濃度為0.1%～0.3%培養8 h條件下存活率大于60%，具有一定耐酸耐膽鹽性；除對林可霉素低敏、對慶大霉素中敏外，對青霉素、頭孢唑啉、克拉霉素、諾氟沙星、萬古霉素、利福平極其敏感；對小鼠器官和腸道無危害，并能提高小鼠日增重和采食量。綜上，枯草芽胞桿菌ECL1.2可作為潛在益生菌。
1 引言
纖維素是一種廣泛存在的可再生生物資源，主要存在于植物和谷物中。使用纖維素降解酶利用纖維素資源是當前的研究熱點，其對于工業和農業經濟的發展有極大的價值1。分泌高效降解組合酶菌株的選育是利用纖維素資源的關鍵，直接從自然環境中篩選菌株具有安全可靠性2。目前，在畜牧禽畜養殖行業，益生菌發酵飼料和發酵中藥等被廣泛用來提高飼料利用率、預防動物疾病、提高生產性能、增強動物機體免疫和改善養殖環境等3?7。益生菌發酵過程中產生的纖維素胞外酶可以與底物作用，使飼料營養成分和中藥有效成分大量釋放，所以產纖維素酶能力的大小是進行發酵菌株篩選的主要指標。芽胞桿菌具有高產纖維素酶的能力，能夠在低pH值下存活，次級代謝產物在宿主體內發揮益生作用，發酵產品在室溫下耐儲存等優勢，因此被認為是最理想的微生物添加劑8?9。
本試驗從綿羊腸道中分離得到8株菌，并從中篩選出一株高產纖維素酶的芽胞桿菌菌株，且對其產蛋白酶和α-淀粉酶能力進行了檢測，研究了其抑制病原菌和耐酸耐膽鹽能力和安全性，為篩選有效利用纖維素資源的益生菌奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
試驗樣品取自10月齡健康綿羊的盲腸和結腸內容物，液氮速凍后-80℃保存；40只4周齡健康雌性昆明小鼠購于河南實驗動物中心。
CMC-Na固體培養基：CMC-Na 5 g、酵母提取物2 g、K?HPO? 1 g、瓊脂20 g，去離子水定容至1 L；LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g、氯化鈉10 g去離子水定容至1 L（固體培養基需再添加20 g瓊脂）。瓊脂、蛋白胨、酵母提取物均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、磷酸氫二鉀等均購自國藥集團化學試劑有限公司；福林酚購于北京索萊寶科技有限公司；剛果紅、復紅染液購自鄭州安圖生物有限公司；3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑、CMC-Na、牛膽鹽、枯草芽胞桿菌生化鑒定管購自青島海博生物有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物有限公司。
1.2 高產纖維素酶菌株的篩選
取采集的腸道內容物樣本10 g，加入裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，震蕩混勻，85℃水浴10 min，倍比梯度稀釋，吸取10??、10??、10??稀釋液100 μL均勻涂布于CMC-Na平板上，37℃培養24 h后選取單菌落純化2代。將分離菌株點種于CMC-Na平板上，做3個重復，用超純水做對照點，37℃培養24 h，剛果紅染色法染色后，觀察菌落周圍的透明圓，測量透明圓直徑（H）與菌落直徑（C）的比值。
將分離菌株接種至LB液體培養基，37℃培養36 h，離心取得上清液即為菌株的粗酶液。采用董雪麗10的DNS方法測定羧甲基纖維素酶（CMC酶）活力。酶活定義：1 mL液體酶在50℃，每分鐘水解CMC-Na底物，產生相當于1 μg葡萄糖的還原糖量，為1個酶活單位（U/mL）。篩選出透明圓直徑與菌落直徑的比值最大以及CMC酶活性最高的菌株作為目標菌株。
1.3 高產纖維素酶菌株鑒定
觀察目標菌株在LB固體培養基上的菌落形態并進行革蘭染色鏡檢，進行菌株形態學觀察。參照《伯杰細菌鑒定手冊》，采用微量生化鑒定管進行菌株生化特征分析。提取菌株的DNA，用27F/1492R通用引物對（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′）進行16S rDNA片段擴增11。由擎科公司進行測序，采用鄰接法構建系統進化樹。
1.4 生長曲線的建立
采用倍比稀釋法用LB平板測定目標菌株在0～46 h的活菌數，每隔2 h進行計數。以培養時間為橫坐標、活菌數量為縱坐標，繪制生長曲線。
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