林氏扇頭蜱抗菌肽重組蛋白對大腸埃希菌生長曲線影響及抑菌效果（三）
2結果
2.1基因克隆鑒定及重組質粒構建與鑒定
以林氏扇頭蜱的cDNA為模版進行序列擴增，得到與預期大小相符約333 bp的目的條帶（圖1A），對特異性條帶進行膠回收，測序后驗證為目的基因。
圖1 Microplusin-like基因擴增、雙酶切和重組蛋白的表達結果注：A.Microplusin-like基因擴增，M.DL2000 marker，1.Microplusin-like PCR產物；B.雙酶切結果，M.DL5000 marker，1.pCold-SUMO；2.pCold-SUMO/Microplusin-like；C.SDS-PAGE結果，M.14.4~116 kDa protein marker，1.pCold-SUMO空載未誘導，2.pCold-SUMO空載誘導，3.重組載體未誘導，4.重組載體誘導，5.重組載體表達沉淀，6.重組載體表達上清，7.純化后的重組蛋白；D.Western Blot結果，M.10~250 kDa蛋白marker，1.空載體誘導，2.重組載體誘導，3.純化后的重組蛋白。
2.2生物信息學分析
該序列由110個氨基酸組成，CAMPR3預測得分（SVM=1.0，RF=0.991）均>0.5，表明其具有潛在抑菌活性；凈電荷數為-5.25，等電點（isoelectric point，PI）為5.29，判斷其屬陰離子；GRAVY值為-0.016，表明其可能具備一定親水性以溶于液體，為后續發揮抗菌作用奠定基礎；Wimley-White為27.31，表明其可能通過疏水作用破壞細菌膜結構；Boman index為1.33，表明該序列在理論上具有較好的抗菌潛力，可能具備有效的抗菌機制。
2.3重組質粒構建、原核表達及純化鑒定
雙酶切結果顯示，在約5 000 bp和333 bp處各有一條與預期大小一致的目的條帶（圖1B），重組質粒可用于蛋白表達。SDS-PAGE結果顯示，pCold-SUMO/Microplusin-like蛋白分子量約為29 kDa（圖1C），與預期相符。Western Blot結果顯示，在約29 kDa處出現目的條帶（圖1D），說明重組蛋白的His標簽被對應的抗體識別。
2.4重組蛋白抑菌功能研究
2.4.1抑菌活性分析
重組蛋白對5株大腸埃希菌及1株沙門菌均表現出抗菌活性（圖2），其中對E.coli ATCC25922、E.coli K88的抑菌圈直徑均大于10 mm，表現出中度敏感，對E.coli 1515、E.coli 987P、E.coli K99、Salmonella pullorum CVCC 1791的抑菌圈直徑大于16 mm，表現出高度敏感，對S.aureus CVCC 1882、S.aureus ATCC 43300未出現抑制效果；卡那霉素陽性對照組抑菌圈直徑均大于16 mm，表現出高度敏感，空白對照組和陰性對照組未觀察到抑菌圈出現，該重組蛋白對革蘭陰性菌均具有一定抑制效果，對革蘭陽性菌無抑制作用。見表1。
圖2 Microplusin-like的抑菌圈試驗結果注：A1~A4依次為:E.coli ATCC 25922陽性對照、陰性對照、空白對照、Microplusin-like；B1~B4依次為Salmonella pullorum CVCC 1791陽性對照、陰性對照、空白對照、Microplusin-like；C.E.coli 1515；D.E.coli 987P；E.E.coli K88；F.E.coli K99；G.S.aureus CVCC 1882；H.S.aureus ATCC4 3300；C~H.紅色箭頭為Microplusin-like，綠色箭頭為陰性對照，藍色箭頭為空白對照，黃色箭頭為陽性對照。
表1 Microplusin-like的抑菌圈直徑mm
注：-.無抑菌圈；同一列不同小寫字母表示差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4.2最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測定
對各供試菌株的MIC及MBC結果表明，重組蛋白對大腸埃希菌及沙門菌具有較高的抑菌活性，除E.coli K88外，最小抑菌濃度均在0.625 mg/mL，但其殺菌活性相對較弱，部分菌株的MBC值超過5 mg/mL，達到了MIC的8倍（表2）。
表2 Microplusin-like的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度mg/mL