甘露聚糖對(duì)S.cerevisiae酵母菌株生長(zhǎng)及抗氧化活性的影響（一）
葡萄酒釀造是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)主導(dǎo)的一系列復(fù)雜的微生物代謝和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，其細(xì)胞活力對(duì)發(fā)酵酒樣中代謝產(chǎn)物的形成具有重要影響[1]。S.cerevisiae生命周期較短，快速衰老會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，揮發(fā)性化合物的合成和分泌能力大大降低，從而嚴(yán)重影響葡萄酒的香氣與感官品質(zhì)[2]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞損傷、衰老和死亡的主要原因之一[3]。S.cerevisiae具有一定的氧化應(yīng)激反應(yīng)能力，可以通過(guò)多種途徑保護(hù)自身免受各種脅迫，如通過(guò)抗氧化酶的水平，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等來(lái)體現(xiàn)其對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)；也可以通過(guò)產(chǎn)生谷胱甘肽(glutathione，GSH)等非酶類自由基清除劑，保護(hù)細(xì)胞不被氧化[4-5]。甘露聚糖及其衍生物在體外可以高效清除多種自由基，其中清除超氧陰離子自由基的能力接近維生素C，具有良好的抗氧化活性[6]。RODRIGUEZ-NOGALES等[7]通過(guò)添加甘露聚糖和商業(yè)酵母制劑，增加了起泡葡萄酒的抗氧化性能。同時(shí)，外源性添加甘露聚糖對(duì)葡萄酒香氣復(fù)雜性和風(fēng)格獨(dú)特性也具有積極影響。COMUZZO等[8]研究表明，添加低質(zhì)量濃度的甘露聚糖可以增加葡萄酒中酯類物質(zhì)含量，而較高質(zhì)量濃度(500 mg/L)會(huì)增加羧酸含量，帶給葡萄酒不愉快的氣味。李惠琳等[9]比較了4種酵母多糖對(duì)霞多麗干白葡萄香氣的影響，結(jié)果顯示甘露聚糖可增加葡萄酒香氣的濃郁度和復(fù)雜性。總體而言，目前關(guān)于酵母甘露聚糖對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)提升方面的研究較多，但關(guān)于甘露聚糖如何通過(guò)影響S.cerevisiae生長(zhǎng)及抗氧化性，從而改變酒體香氣合成釋放的內(nèi)在機(jī)制研究鮮有報(bào)道。
本研究以模擬葡萄汁為原料，考察外源性添加甘露聚糖對(duì)S.cerevisiae菌株生長(zhǎng)及細(xì)胞完整性的影響，初步探討酒精發(fā)酵過(guò)程中S.cerevisiae菌株抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步研究甘露聚糖對(duì)葡萄酒發(fā)酵香氣的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
釀酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；甘露聚糖MP 60，安琪酵母股份有限公司。
ATP酶、SOD活性測(cè)定試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、GSH、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；纖維二糖、磷酸氫二銨、酒石酸氫鉀、檸檬酸、磷酸氫二鉀等試劑均為分析純，天津光復(fù)化工研究所。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1模擬葡萄汁的配制
參考祝霞等[10]的方法。葡萄糖200 g/L、纖維二糖0.2 g/L、磷酸氫二銨1.5 g/L、酒石酸氫鉀2.5 g/L、L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸0.2 g/L、磷酸氫二鉀1.14 g/L、硫酸鎂1.23 g/L。
1.2.2甘露聚糖對(duì)釀酒酵母菌株生物量和活力的影響
在2 L的模擬葡萄汁(2.5 L棕色罐)中，分別添加100、200、300、400、500 mg/L的甘露聚糖(編號(hào)分別為MP1～MP5)，以不添加酵母多糖為對(duì)照(CK)。按照推薦用量0.2 g/L接種Aroma White，25℃控溫發(fā)酵，每隔24 h測(cè)定模擬汁中酵母細(xì)胞的生物量(OD600)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。每個(gè)樣品設(shè)置3組平行，結(jié)果取平均值。下同。
在模擬葡萄汁中分別添加100、200、300、400、500 mg/L(MP1～MP5)的甘露聚糖，以不添加酵母多糖為對(duì)照(CK)，25℃控溫發(fā)酵。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，自接種開(kāi)始2、4、7 d分別對(duì)應(yīng)菌株生長(zhǎng)的前、中、后期，參照文獻(xiàn)[11]酵母活力測(cè)定方法，檢測(cè)3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期酵母菌株活力，分析甘露聚糖對(duì)S.cerevisiae細(xì)胞活力的影響。
1.2.3酵母細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定
1.2.3.1酵母細(xì)胞中ATP酶活性測(cè)定
參照符安[12]的方法并做修改，收集酵母細(xì)胞，3 500 r/min離心10 min，傾倒上清液，用5 mL生理鹽水(0.9%)洗滌3次后稱重，加入生理鹽水，冰水浴超聲破碎(4℃，40%功率，開(kāi)啟5 s，停止7 s，共計(jì)1 min)，制成0.063 g/mL的勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。
1.2.3.2酵母細(xì)胞中SOD活性測(cè)定
收集酵母細(xì)胞，用20倍體積的PBS，1 000 r/min離心10 min洗滌酵母細(xì)胞。重復(fù)2次后，再加入20倍體積的生理鹽水以3 500 r/min離心10 min，冰水浴條件下超聲破碎，制成10%的細(xì)胞勻漿，再將勻漿稀釋5倍，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。
1.2.3.3酵母細(xì)胞中ROS含量測(cè)定
取模擬汁，離心10 min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，再用PBS重懸，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入熒光探針(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，在最佳波長(zhǎng)500 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處進(jìn)行熒光檢測(cè)。
1.2.3.4酵母細(xì)胞中MDA含量測(cè)定
參照1.2.3.2的方法制成10%的組織勻漿，再將勻漿稀釋5倍，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。
1.2.3.5酵母細(xì)胞及模擬汁中GSH含量測(cè)定
取模擬汁發(fā)酵液10 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH含量。按照1.2.3.2的方法，制成10%的組織勻漿，進(jìn)行酵母細(xì)胞中GSH含量測(cè)定。
1.4數(shù)據(jù)分析
使用Microsoft Excel 2007對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行多重比較(Duncan法，P<0.05)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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