RIP 衍生物對(duì)?耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線及生物膜形成的影響（一）
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的群體感應(yīng)系統(tǒng)-附屬基因調(diào)節(jié)（agr）系統(tǒng)，調(diào)控多種毒力因子表達(dá)，其中最重要的一類毒力因子是葡萄球菌溶素。MRSA 還能夠表達(dá)一些黏附蛋白，促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成。這些毒力因子在MRSA 侵襲性感染過程中發(fā)揮重要作用。RNAⅢ抑制肽（RIP）是agr 系統(tǒng)抑制劑。本研究設(shè)計(jì)合成了新的RIP 衍生物RIP1183，檢測(cè)其對(duì)MRSA 的生長(zhǎng)和生物膜形成的影響，以及在不同時(shí)相對(duì)重要毒力因子表達(dá)的影響，探討RIP1183 抗菌、抗生物膜的作用機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 試劑
微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN），細(xì)菌RNA 提取試劑盒RNAprep pure Bacteria Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Kit，Premix Taq RT-PCR 系統(tǒng)（TaKaRa）。異硫氰酸熒光素（FITC）、葡萄糖均購(gòu)自Sigma 公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。
1.2 菌株和藥品
MRSA（USA300）由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）的Michael Otto 教授友情惠贈(zèng)。RIP1183 由本課題組設(shè)計(jì)，委托空軍軍醫(yī)大學(xué)生物制藥教研室合成，白色疏松粉末，批號(hào)：20141001，含量：99.41%，保存條件：-20℃低溫保存。
1.3 細(xì)菌培養(yǎng)
按照1∶100 的比例接種MRSA（USA300）至5 mL的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14 h，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌分別轉(zhuǎn)接至10 mL TSB 培養(yǎng)基 （含0.5%的葡萄糖），將細(xì)菌濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。RIP 組加入RIP1183使其終濃度為50 μg/mL。對(duì)照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 測(cè)定1 次吸光度（OD）630值，監(jiān)測(cè)12 h 內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
收集菌體，細(xì)菌培養(yǎng)操作同上，每隔2 h 吸取100 μL 菌液，12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄去上清，收集沉淀（細(xì)菌），保存至-80℃冰箱中。
1.4 細(xì)菌生物膜
細(xì)菌過夜培養(yǎng)，用含有0.5%葡萄糖的TSB 培養(yǎng)液將菌液稀釋至1×106CFU/mL，接種于48 孔培養(yǎng)板中。RIP 組加入RIP1183，使藥物終濃度為50 μg/mL，對(duì)照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃濕盒中孵育48 h后，棄上清，無菌磷酸鹽洗掉浮游菌和雜質(zhì)。然后用FITC（0.1 mg/mL）標(biāo)記貼壁細(xì)菌，無菌磷酸鹽清洗3 次，避光4℃保存，熒光顯微鏡（Olympus，CKX41）觀察貼壁細(xì)菌并拍照。使用Image J 軟件定量分析熒光強(qiáng)度。
1.5 qRT-PCR
為了探討金黃色葡萄球菌不同生長(zhǎng)時(shí)相，agr 系統(tǒng)的激活情況，以及RIP1183 對(duì)細(xì)菌葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別檢測(cè)細(xì)菌遲緩期（2 h）、對(duì)數(shù)期（6 h）和穩(wěn)定期（10 h）16S rRNA、RNAⅢ、人類白細(xì)胞抗原（HLA）、icaA 和fnbA 基因的表達(dá)水平。
收集的細(xì)菌，按照微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit 說明書，提取細(xì)菌總RNA。將RNA 溶于30 μL的DEPC 水，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit 獲得cDNA。qRT-PCR 反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA 2 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上游引物（10 μm）1 μL，下游引物（10 μm）1 μL，無菌ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：segment 1：95℃、5 min；segment 2：95℃、10 s，55℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；segment 3：95℃、15 s，55℃、60 s，95℃、15 s；每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次。用2-ΔΔCT法計(jì)算分析各組基因相對(duì)于內(nèi)參基因16S rRNA的表達(dá)量。用于檢測(cè)基因表達(dá)水平的引物序列，見表1。
表1 用于檢測(cè)基因表達(dá)水平的引物序列
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用GraphPad Prism Version 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 RIP1183 對(duì)MRSA（USA300）生長(zhǎng)曲線的影響
MRSA（USA300）培養(yǎng)在含葡萄糖的TSB 培養(yǎng)基中，2 h 后由遲緩期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期；RIP 組加入RIP1183（50 μg/mL），MRSA（USA300）同樣是在2 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。與對(duì)照組比較，RIP1183 不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。
圖1 RIP1183 對(duì)MRSA（USA300）生長(zhǎng)曲線的影響
2.2 RIP1183 對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響
與對(duì)照組比較，RIP 組細(xì)菌生物膜形成顯著減少（P ＜0.01）。見圖2。
RIP 衍生物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線及生物膜形成的影響（一）
RIP 衍生物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線及生物膜形成的影響（二）
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