Y群腦膜炎奈瑟菌對(duì)13種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)——摘要、材料與方法
摘要
目的了解海南省Y群腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）流行病學(xué)、分子特征及對(duì)抗菌藥物的敏感性，為Y群流行性腦脊髓膜炎（流腦）的預(yù)防控制和治療提供科學(xué)依據(jù)。方法對(duì)海口市2022年5月發(fā)現(xiàn)的2例流腦病例患者血液標(biāo)本和密切接觸者咽拭子進(jìn)行腦膜炎奈瑟菌分離培養(yǎng)、生化和普通聚合酶鏈反應(yīng)種屬鑒定，將得到的Nm用玻片凝集法和熒光聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行血清分群和基因分群；用二代全基因組測序技術(shù)對(duì)7株Nm進(jìn)行全基因組測序；用E-test試紙條法進(jìn)行13種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果2例患者都是青少年。從患者和密切接觸者中共獲得7株Nm分離株，其中2株來自患者，5株來自密切接觸者。7株Nm血清分群結(jié)果與基因分群結(jié)果一致，均是Y群Nm。所有分離株基因序列GC含量在51.84%~51.86%，序列型是ST-1655型，屬于ST-23克隆群。外膜蛋白porA（P1.5-1,10-1）、porB（3-117）和fetA（F4-1）基因分型結(jié)果均一致。7株Nm的耐藥相關(guān)基因序列完全相同。所有菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、美羅培南、氯霉素、阿奇霉素、米諾環(huán)素、利福平、環(huán)丙沙星、萘啶酸、左氧氟沙星敏感，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥。結(jié)論海南省已發(fā)現(xiàn)ST-1655型血清Y群Nm感染病例，應(yīng)加強(qiáng)該地區(qū)流腦菌群監(jiān)測，推廣流腦ACWY群四價(jià)疫苗接種，防止Y群流腦發(fā)病和死亡。
流行性腦脊髓膜炎（epidemic cerebrospinal meningitis，ECM）簡稱流腦，是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）引起的急性呼吸道傳染病，具有起病急、病情發(fā)展快和病死率高等特點(diǎn)。人是腦膜炎奈瑟菌唯一宿主，多數(shù)人感染后表現(xiàn)為隱性感染，少數(shù)人會(huì)引起流腦或侵襲性菌血癥。Nm根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)可分為12個(gè)血清群（A、B、C、X、Y、Z、E、W、L、H、I和K），其中A、B、C、X、Y和W是導(dǎo)致人類疾病常見的血清群。目前全球面臨多個(gè)血清群Nm流行和變遷威脅。我國近年A群、C群病例明顯減少，B群、W群、Y群病例呈增加趨勢(shì)。2022年5月海南省確診2例Y群流腦病例，并從流腦患者全血和密切接觸者咽拭子中分離到了7株Nm，現(xiàn)將其流行病學(xué)、分子特征和藥敏結(jié)果報(bào)告如下。
1材料與方法
1.1標(biāo)本資料
病例1，男，19歲學(xué)生，天津市人，居住海口市瓊山區(qū)，2022年5月25日發(fā)病，26日采集全血樣本送檢，5月27日采集與患者密切接觸者（密接者）80份咽拭子現(xiàn)場接種雙抗巧克力平板送檢。病例2，男，15歲輟學(xué)學(xué)生，海南屯昌人，居住海口市龍華區(qū)，5月9日發(fā)病，5月27日采集全血培養(yǎng)瓶送檢。6月2日采集與患者密切接觸者57份咽拭子現(xiàn)場接種雙抗巧克力平板送檢。
1.2主要試劑與儀器
血平板、普通巧克力平板、雙抗平板（廣東環(huán)凱）；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒（德國QIAGEN公司）；Nm雙重核酸、Nm（A型、B型、C型）和Nm（X型、Y型、W135型）三重核酸檢測預(yù)分裝試劑盒（深圳市生科源）；NH奈瑟菌鑒定卡（法國生物梅里埃）；兔抗腦膜炎球菌診斷血清試劑（青島中創(chuàng)匯科）；羊血M-H平板（廣州迪景）；13種抗菌藥物E-test紙條（意大利liofilchem公司）。Nm基因組測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。儀器：二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Tpersonal PCR儀（德國Biometra公司），Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。
1.3方法
1.3.1病原學(xué)檢測
將病例1全血、病例2血液培養(yǎng)瓶標(biāo)本接種的血平板、巧克力平板和病例1的80份、病例2的57份密接者咽拭子雙抗平板，置5%CO2，36.5℃培養(yǎng)24~48 h。取疑似菌分純后做氧化酶試驗(yàn)，VITEK 2 NH奈瑟菌生化鑒定。密接者分離株用普通聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）進(jìn)行Nm種屬鑒定。確定為Nm的菌株用腦膜炎奈瑟菌診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，基因分群使用商品化試劑盒熒光PCR擴(kuò)增Nm莢膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因（ctrA基因）、銅-鋅超氧化物歧化酶基因（sodC基因）和A、B、C、W、X、Y群特異性基因。
1.3.2全基因組測序
提取基因組DNA，按QIAamp DNA Mini Kit說明書操作，每株菌提取4管，每管100μL送上海生工進(jìn)行二代全基因組高通量測序，要求：基因組覆蓋度≥95%，基因區(qū)覆蓋度≥98%，整體覆蓋度≥100X，Scaffold個(gè)數(shù)<100個(gè)，Contig數(shù)量<200個(gè)，單堿基錯(cuò)誤率低于1/105。測序質(zhì)量控制：PE150及以上測序，原始數(shù)據(jù)量（堿基數(shù)）≥1.5 G，高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)（Q20）≥1 Gb，Q30比例≥85%。最終獲得拼接好的全基因組框架圖序列。將基因組框架圖序列上傳PubMLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（https://pubmlst.org/neisseria）進(jìn)行在線分析，獲得菌株序列型（sequence type,ST）、克隆群（clone complex,CC）、耐藥基因、疫苗相關(guān)蛋白基因以及外膜蛋白基因porA（包括可變區(qū)VR1和VR2）、porB和fetA的基因型和亞型。Nm基因亞型書寫按“血清群:porA VR1基因型，VR2基因型:fetA基因型:ST型（克隆群）”。
1.3.3藥物敏感性試驗(yàn)
參考2019年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的《抗微生物藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》，采用微生物快速藥敏監(jiān)測系統(tǒng)測定Nm菌株對(duì)13種抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）。經(jīng)鑒定的腦膜炎奈瑟菌接種巧克力平板36℃，5%CO2培養(yǎng)22 h，取菌落用3 mL滅菌生理鹽水制備濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木海苯油坎佳蜓狹-H平板，每個(gè)M-H平板只能貼1根E-test試紙條，置36℃，5%CO2培養(yǎng)22 h后讀取MIC值，試驗(yàn)同時(shí)用ATCC49619和ATCC25922做質(zhì)控。結(jié)果判定按2019年CLSI推薦標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告。
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Y群腦膜炎奈瑟菌對(duì)13種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)——結(jié)果
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