皮膚科門診甲真菌病患者的菌種分布和體外藥敏試驗
甲真菌病是甲及其周圍組織的真菌感染，是皮膚科最常見的甲病，占甲病的50%。致病真菌包括皮膚癬菌、念珠菌等酵母菌及非皮膚癬菌性霉菌等。其中，紅色毛癬菌是最常見的致病菌，約占90%。本文對我院2014年11月～2015年1月皮膚科門診甲真菌病患者的菌種分布和體外藥敏試驗做一回顧性分析，為臨床診斷治療提供用藥依據。
1資料與方法
1.1研究對象
受試者為我院皮膚科門診2014年11月～2015年1月就診的甲真菌病患者，臨床表現典型者予以真菌直接鏡檢和真菌培養以明確診斷。登記年齡和性別等一般資料。
1.2實驗室檢查
刮取病甲甲屑做真菌直接鏡檢并同步進行真菌培養。
真菌直接鏡檢取甲屑置于載玻片上；加1滴15%KOH溶液，蓋上蓋玻片；放置片刻或酒精燈火焰微加熱，即在火焰上快速過火2～3次不應沸騰；輕壓蓋玻片；冷卻后先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察菌絲和孢子的形態、特征、位置、大小和排列等。
真菌培養鑒定甲屑標本接種在含有50μg/mL氯霉素和500μg/mL的放線菌酮的沙堡斜面培養基(SDA)上，每個樣本接種2管，置于25～28℃培養14 d。絲狀真菌通過菌落形態和小培養顯微鏡下特征鑒定；念珠菌通過轉種科瑪嘉念珠菌顯色培養基或API20CAUX測試板條鑒定。
1.3體外藥敏試驗
抗真菌藥物咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、聯苯芐唑和特比萘芬為原藥藥粉，均來自Selleck Chemicals公司(咪康唑批號S253601，酮康唑批號S135302，氟康唑批號02，伊曲康唑批號S247603，聯苯芐唑批號S185402，特比萘芬批號S172501)，藥物純度達99.9%。各藥物濃度范圍為：氟康唑0.125～64μg/mL；伊曲康唑、酮康唑、聯苯芐唑和咪康唑0.03～16μg/mL；特比萘芬0.007 8～4μg/mL。
質控菌株須癬毛癬菌ATCC MYA 4439和近平滑念珠菌ATCC 22019，均來源于第二軍醫大學長征醫院皮膚科惠贈。
試驗方法皮膚癬菌參考改良的絲狀真菌M38-A2方案，念珠菌參考M27-A3方案。用試管倍比稀釋法制備藥物稀釋液10個濃度梯度，分別加入96孔板的1～10列，每孔均為0.1 mL，第11列為生長對照，只含有0.1 mL RPMI-1640，不含抗真菌藥物，第12列作陰性對照，均為0.2 mL的RPMI-1640。將純化的菌種培養成熟后制備菌懸液，應用比濁儀結合血細胞計數板肉眼計數，RPMI-1640稀釋，最終將絲狀真菌調整菌懸液濃度至(1～5)×104CFU/mL，念珠菌調整至(1～5)×103CFU/mL。將制備好的菌懸液接種至藥敏板上第1～11列，每孔均為0.1 mL。絲狀真菌28℃、念珠菌35℃溫箱靜止孵育培養。絲狀真菌96 h、念珠菌24 h開始觀察結果，用肉眼觀察結合酶標儀測OD值判定終點，與陽性對照孔比較，咪康唑、聯苯芐唑、酮康唑、氟康唑和特比萘芬取80%的生長抑制作為終點判定，伊曲康唑取100%的生長抑制為終點判定。每株受試菌株均重復實驗2次，結果平行。
2結果
2.1一般資料
102例臨床懷疑甲真菌病患者中，真菌鏡檢陽性率61.8%(63/102)，培養陽性率80.4%(82/102)。真菌培養陽性患者中，男∶女=1∶1.73；患者發病年齡4～77歲，平均(46±15.3)歲；指甲∶趾甲=1∶1.1。50歲以上的老年人指甲感染更常見，指甲∶趾甲=2.25∶1(見表1)。
2.2菌種分布
共分離到82株真菌，其中皮膚癬菌60例(73.2%)，念珠菌屬21例(25.6%)，非皮膚癬菌霉菌1例(1.2%)(見表2)。
2.3體外藥敏試驗
82株臨床分離株對咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、聯苯芐唑和特比萘芬的MIC濃度范圍與幾何均數情況(見表3)。皮膚癬菌對咪康唑、酮康唑、氟康唑、聯苯芐唑和特比萘芬幾何均數較低，提示敏感性較好，但是也有個別菌株在藥物工作濃度范圍內不敏感。根據M27-S4念珠菌的敏感性折點判定結果，80%以上的近平滑念珠菌對咪康唑、酮康唑、聯苯芐唑和特比萘芬敏感，4株對氟康唑耐藥，3株對伊曲康唑中度敏感；70%以上的白念珠菌對酮康唑和聯苯芐唑的敏感；1株熱帶念珠菌除對聯苯芐唑耐藥外，對其他試驗菌株都敏感。1株毛霉菌對所有實驗藥物均不敏感。
表1 82例甲真菌病患者年齡段和性別分布
表2甲真菌病患者82株分離株菌種分布
表3常見抗真菌藥物對82株甲真菌病臨床分離株的體外藥敏結果(μg/mL)
3討論
甲真菌病的發病率逐年增高，在老年人中更常見。我們研究發現50歲以上的老年人占調查人數的47.57%，與Dorko報道的一致。女性的發病率明顯高于男性，尤其在40～49歲年齡段，男女構成比是1∶5.5，可能和女性更注重外表美觀而就診意愿高于男性有關。
我國各地綜合的病原學調查中顯示皮膚癬菌約占65%～70%，酵母菌約占10%～30%，主要分布在南方溫暖潮濕地區。我們的研究結果顯示皮膚癬菌占73.2%，念珠菌屬占25.6%，與文獻結果相符。
隨著抗真菌藥物在臨床上的廣泛應用，念珠菌感染的耐藥也日趨升高，尤其是唑類抗真菌藥物常是臨床經驗性治療的首選藥物。因此，對臨床分離株進行菌種鑒定和體外藥敏試驗有助于臨床醫師了解念珠菌對抗真菌藥物的敏感情況和選擇用藥。我們的藥敏結果顯示，絕大部分紅色毛癬菌和須癬毛癬菌對臨床常用的抗真菌藥物的MIC值幾何均數較低，提示敏感。氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬和聯苯芐唑對須癬毛癬菌的MIC值范圍與之前文獻報道的結果幾乎相同。我們分離到的酵母菌主要為白念珠菌和近平滑念珠菌，各為10株(12.2%)。10株白念珠菌中，各有5株對氟康唑和伊曲康唑耐藥，與文獻報道的氟康唑(54.1%)和伊曲康唑(53.4%)耐藥情況一致，這可能與臨床長期廣泛使用氟康唑和伊曲康唑有關。白念珠菌和近平滑念珠菌對特比萘芬的敏感性分別為20%(2/10)和80%(8/10)，與文獻報道的4.9%和87.5%相近。
藥敏試驗采用酶標儀與肉眼共同判讀結果，具有較好的一致性。利用酶標儀讀取結果可以提高靈敏度與精確度，使結果更加客觀準確，減少主觀視覺的誤差，可行性高，可提高效率。治療前了解致病真菌的菌種和體外藥敏情況有助于臨床醫師參考用藥。