白馬耳組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)、冷凍前及復(fù)蘇后存活率、生長(zhǎng)曲線繪制（三）
2.3烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后存活率對(duì)比
凍存前后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞呈透明(圖4)，由于視野有限，僅挑選具有代表性的圖片于文章中，并非全部圖片。烏珠穆沁白馬耳組織不同代次成纖維細(xì)胞在冷凍保存前細(xì)胞存活率差別很小，存活率均達(dá)到98%以上，沒(méi)有顯著性差異;隨著細(xì)胞冷凍保存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率逐漸下降，復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率明顯低于凍存前，存活率在80%左右。但雌性烏珠穆沁白馬耳組織P9細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率仍能達(dá)到90%以上(圖5)。
每組重復(fù)3次;、代表差異顯著(P<0.01、P<0.05)。
2.4烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的不同代次生長(zhǎng)曲線對(duì)比
烏珠穆沁白馬細(xì)胞倍增時(shí)間隨著培養(yǎng)代次的增加而增加，而倍增次數(shù)則隨培養(yǎng)代次的增加而減少(表1)，說(shuō)明隨著培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞增殖速度下降，活力降低。雄性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型(圖6a)，低代次細(xì)胞增殖速度較培養(yǎng)高代次細(xì)胞快，在培養(yǎng)6d或7d時(shí)細(xì)胞增殖數(shù)目達(dá)到最大值。雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞在P3~P6時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型(圖6 b)，生長(zhǎng)速度最快，P9時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線走勢(shì)平緩，生長(zhǎng)活力沒(méi)有明顯的變化。
2.5烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞不同代次及不同時(shí)間的貼壁率對(duì)比
烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的貼壁率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，6 h和12 h貼壁率均在較低的水平，24 h后貼壁率快速上升，大部分保持在90%左右(圖7)。
2.6烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞染色體核型
使用顯微鏡以及遺傳工作站拍照測(cè)量及排列雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞染色體，并統(tǒng)計(jì)成纖維細(xì)胞核型，從而判斷成纖維細(xì)胞遺傳的穩(wěn)定性。體外培養(yǎng)的雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞染色體條數(shù)均為2n=64，其中，31對(duì)常染色體，1對(duì)性染色體(圖8)。本實(shí)驗(yàn)選取的雄性、雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且維持了細(xì)胞的遺傳信息穩(wěn)定性。
3討論
本研究成功建立了雄性和雌性烏珠穆沁白馬的耳組織成纖維細(xì)胞系，并進(jìn)行了相關(guān)的生物學(xué)特性分析，以檢測(cè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞活力及其遺傳穩(wěn)定性，包括細(xì)胞貼壁率的測(cè)定、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制、細(xì)胞冷凍前及復(fù)蘇后存活率的測(cè)定、細(xì)胞染色體核型的分析、細(xì)胞系支原體污染的檢測(cè)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的數(shù)據(jù)資料及穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)材料。
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，雌性和雄性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)略有差別，低代次時(shí)，雌性耳組織成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及時(shí)間等各方面優(yōu)于雄性耳組織成纖維細(xì)胞，細(xì)胞貼壁率整體呈現(xiàn)貼壁時(shí)間長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)貼壁率與其他物種細(xì)胞相比較低。研究顯示，狍狍(Capreolus gray)(郭曉楠2021)以及馴鹿(Rangifer tarandus)(王丹妮2021)的耳組織細(xì)胞在6~12h內(nèi)迅速貼壁，而本實(shí)驗(yàn)中烏珠穆沁白馬耳組織細(xì)胞的貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，可能是與細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子數(shù)量有關(guān)，但培養(yǎng)24h后烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的貼壁率與其他物種無(wú)顯著差異。雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞低代次貼壁所需時(shí)間較長(zhǎng)，隨著代次的增加，貼壁所需時(shí)間減少，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定且狀態(tài)良好；雄性耳組織成纖維細(xì)胞隨著細(xì)胞培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞貼壁率穩(wěn)定所需時(shí)間也逐漸增加，在較低培養(yǎng)代次時(shí)細(xì)胞的貼壁率穩(wěn)定性最強(qiáng)。烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線整體呈典型的"S"型，其中雌性成纖維細(xì)胞在P3時(shí)最大增殖細(xì)胞數(shù)量為46.38×10?個(gè)。對(duì)馴鹿耳組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞建系培養(yǎng)并進(jìn)行生物學(xué)特性分析，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，P45的最大增殖細(xì)胞數(shù)量為37.1×10?個(gè)(王丹妮2021)；對(duì)兔(Oryctolagus cuniculus)脾成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代建系培養(yǎng)并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析，通過(guò)生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)該成纖維細(xì)胞在P67的最大增殖細(xì)胞數(shù)量為1.5×10?個(gè)(羅怡琳等2019)。烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞經(jīng)冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率相對(duì)較好，與穆瑤等(2019)對(duì)中華鼢鼠(Eospalax fontanierii)成纖維細(xì)胞存活率的研究結(jié)果相近。郭曉楠(2021)對(duì)狍狍成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后存活率的研究結(jié)果則略低于本研究，且不同代次狍狍成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞存活率存在顯著性差異，甚至于細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率低至13%。根據(jù)比較分析可知，烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的存活率較強(qiáng)，耐受冷凍性強(qiáng)，適合冷凍保存。
染色體核型的制備前期需要用秋水仙素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以獲得更多處于中期分裂相的細(xì)胞，而處理時(shí)間以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞的低滲時(shí)間需要根據(jù)細(xì)胞的類型及生長(zhǎng)狀況而定(于漾等2014，盧文亮等2021)，秋水仙素處理時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)直接影響染色體的形態(tài)，若處理時(shí)間太長(zhǎng)，得到的染色體會(huì)呈現(xiàn)短粗型，低滲時(shí)間若太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，制備得到的染色體大概率會(huì)出現(xiàn)丟失的情況(郭曉楠2021)。對(duì)阿巴嘎黑馬耳組織成纖維細(xì)胞的染色體核型研究得到其染色體條數(shù)為2n=64(王愛(ài)虹等2013)；對(duì)阿拉伯馬成纖維細(xì)胞的染色體核型研究得到染色體條數(shù)為2n=64(張靜南等2011)；采用外周血淋巴細(xì)胞短期培養(yǎng)方法，對(duì)蒙古馬染色體進(jìn)行了核型分析，其二倍體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=64(晁玉慶等1992)。本實(shí)驗(yàn)中烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞染色體條數(shù)為2n=64，且據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示雄性、雌性烏珠穆沁白馬耳組織細(xì)胞染色體中2n=64的比例占80%、85%，表明此研究培養(yǎng)得到的烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞可穩(wěn)定遺傳且具有良好的狀態(tài)。
通過(guò)組織貼壁培養(yǎng)得到的烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多項(xiàng)生物學(xué)特性分析可知，細(xì)胞具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，純度高、增殖能力強(qiáng)，并且具有遺傳穩(wěn)定性，可對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。
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