不同溫度、包裝方式的草莓中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線（一）
摘要：在對(duì)草莓的病源微生物污染調(diào)查中發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌具有高的檢出率。為比較不同溫度和不同包裝方式的草莓表面蠟樣芽孢桿菌數(shù)量的變化情況，測(cè)定了7℃、15℃、25℃、30℃的溫度條件下，采用保鮮盒包裝和保鮮膜包裝方式的草莓表面蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)數(shù)據(jù)；選用Baranyi Roberts模型為初級(jí)模型，擬合不同溫度和不同包裝方式的草莓中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果顯示，7℃冷藏的蠟樣芽孢桿菌均增長(zhǎng)緩慢而與包裝方式無關(guān)；15℃低溫貯藏過程中，膜裝與盒裝延滯期基本相同，但膜裝比盒裝降低了0.7 lg cfu/g的生長(zhǎng)勢(shì)，說明保鮮膜在此溫度下有一定的抑菌作用；在25℃、30℃儲(chǔ)藏下兩種包裝方式的比生長(zhǎng)速率和延滯期基本相同，蠟樣芽孢桿菌在42 h后分別增長(zhǎng)了2.9 lg cfu/g、3.2 lg cfu/g，表明貯藏溫度是影響蠟樣芽孢桿菌的主要因素。因此在高溫條件下蠟樣芽孢桿菌會(huì)帶來潛在的食用安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果為微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要信息。
草莓因其風(fēng)味獨(dú)特、質(zhì)地柔軟受到廣大消費(fèi)者的喜愛，但其柔軟質(zhì)地和高含糖量也成為微生物繁殖生長(zhǎng)的溫床。對(duì)草莓等即食果蔬安全評(píng)價(jià)和管控措施多集中在農(nóng)藥殘留等方面，但有研究表明，草莓表面的微生物也可成為其食用安全的隱患。蠟狀芽胞桿菌是典型的菌體細(xì)胞，分布廣，對(duì)熱等致死因子有較強(qiáng)的抵抗力，在農(nóng)業(yè)上部分菌株被作為生態(tài)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行開發(fā)和利用。但某些蠟樣芽孢桿菌會(huì)產(chǎn)生嘔吐毒素和多種腸毒素而會(huì)引起食物中毒，公認(rèn)食物中毒類型為嘔吐型和腹瀉型，典型腸毒素為溶血致死腸毒素BL(Hbl)、非溶血性腸毒素（Nhe）和細(xì)胞毒性腸毒素（CytK）等，由于此菌不分解蛋白質(zhì)，因此食品在感官上無明顯變化，易誤食發(fā)生食物中毒，我國1973-2013年的食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件占所有食物中毒的構(gòu)成比12.95%（位居第二）。蠟樣芽孢桿菌在我國的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中少有限量，但在多數(shù)境外標(biāo)準(zhǔn)中有限量要求，見表1所示。
預(yù)測(cè)微生物學(xué)(predictive microbiology)是一門建立在微生物學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上的新興學(xué)科，微生物預(yù)測(cè)模型的建立為微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(QMRA)和危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)(HACCP)提供了科學(xué)依據(jù)，是管理食品安全的重要工具。
表1國內(nèi)外即食食品中蠟樣芽孢桿菌限量要求
本研究結(jié)合多年草莓中蠟樣芽孢桿菌的檢出數(shù)據(jù)及宏基因組方法對(duì)草莓表面微生物群落的調(diào)查，通過擬合草莓上市時(shí)溫度和常見不同包裝方式下蠟樣芽孢桿菌在草莓中的生長(zhǎng)情況，建立各溫度下細(xì)菌預(yù)測(cè)模型，并進(jìn)行模型可靠性驗(yàn)證，旨在推薦合理的草莓貯藏方式，為開展定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和保障草莓質(zhì)量安全提供理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料、試劑
1.1.1材料
草莓，120份樣品購于成都大型超市及成都某生產(chǎn)基地，每年度40份樣品。蠟樣芽孢桿菌（ATCC 11778）。
1.1.2試劑
甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂(MYP)、緩沖蛋白胨水（BPW）、營養(yǎng)瓊脂，購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司；0.75%NaCl，法國梅里埃公司；乙腈（色譜純）、乙醇（色譜），F(xiàn)isher Scientific公司；甲酸（色譜純），TEDIA公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）(suitable for MALDI-TOF-MS)，SIGMA公司。實(shí)驗(yàn)用水均為ddH2O。
1.2方法
1.2.1草莓中蠟樣芽孢桿菌的計(jì)數(shù)
草莓蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查草莓的計(jì)數(shù)方法參照4789.14食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)法一。確定性驗(yàn)證采用基質(zhì)輔助解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS）方法。
質(zhì)譜前處理：取菌適量加入70%乙醇水溶液0.75 mL，震蕩30 s，常溫40 kHz超聲10 min，離心1 min棄上清，加入75%乙酸水溶液0.75 mL震蕩20 s，加入0.75 mL乙腈震蕩均勻，常溫40 kHz超聲10 min，離心1 min取上清1μL點(diǎn)至靶板，加入1μL CHCA，晾干。
質(zhì)譜條件：模式Mode liner SARAMIS，能量角75～85，收集范圍2000～20000（m/z），每樣品100次收集峰疊加，校準(zhǔn)品ATCC 8739大腸桿菌。收集質(zhì)譜圖譜導(dǎo)入SARAMIS數(shù)據(jù)庫與數(shù)據(jù)庫中與標(biāo)準(zhǔn)菌株的譜圖進(jìn)行多重比較，獲得鑒定相關(guān)結(jié)果。
1.2.2生長(zhǎng)模型的建立
實(shí)驗(yàn)設(shè)置在7℃、15℃、25℃、30℃條件下設(shè)置溫度點(diǎn)，在0 h、3h、6h、9 h、18 h、21 h、23.5 h、26.5 h、29 h、31 h、41 h、45 h、52 h、72 h、75 h選擇溫度點(diǎn)進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ComBase數(shù)據(jù)庫的在線軟件，選取Baranyi模型作為一級(jí)模型進(jìn)行曲線擬合，方程式：
式中：t為時(shí)間，h；Y(t)為t時(shí)的菌數(shù)，cfu/g；Y0為初始菌數(shù)，cfu/g；Y max為最大菌數(shù)，cfu/g；μmax為最大比生長(zhǎng)速率；λ表示遲滯時(shí)間，h；h0表示初始時(shí)細(xì)胞的生理狀態(tài)。
1.2.3模型的驗(yàn)證
為了評(píng)價(jià)建立的動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)值的可靠性，實(shí)驗(yàn)采用準(zhǔn)確因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Bias factor，Bf）和均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE）對(duì)預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行分析檢驗(yàn)。RMSE、Af和Bf表達(dá)式見公式（4～6）
式中：Nobs表示實(shí)測(cè)值，Npre表示應(yīng)用模型得到的預(yù)測(cè)值，n是觀測(cè)值個(gè)數(shù)。
不同溫度、包裝方式的草莓中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線（一）
不同溫度、包裝方式的草莓中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線（二）
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