產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（五）
2.8鹽度對(duì)LD-1302產(chǎn)酶的優(yōu)化
由圖8可知：以橄欖油為有機(jī)碳源、接種量為3.75×105CFU/mL、pH 8、37℃時(shí)，菌株LD-1302在鹽度32時(shí)有最大脂肪酶活，為（34.97±1.45）U/mL。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)可知：鹽度、時(shí)間的P=0.00<0.01，表明鹽度、時(shí)間均對(duì)酶活影響極顯著；由鹽度-酶活的同類子集結(jié)果可知：鹽度36時(shí)酶活均值為22.88 U/mL；鹽度28、30、34時(shí)酶活均值分別為25.71U/mL、28.60U/mL、27.29U/mL，在同一子集中，表明三者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無(wú)明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活效果略優(yōu)于前者；鹽度32時(shí)酶活均值為30.59 U/mL，且與前四者分屬不同子集，表明鹽度32時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、48 h、72 h時(shí)酶活均值分別為27.72U/mL、30.65U/mL、22.68U/mL，分屬不同子集，表明三者對(duì)酶活的影響有明顯差異，且培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。隨著鹽度的增加或減少，菌株LD-1302的產(chǎn)脂肪酶活性都有一定程度的降低，尤其是隨鹽度的增加，脂肪酶活下降較為顯著。
圖8鹽度對(duì)LD-1302利用橄欖油產(chǎn)脂肪酶的影響
3討論
本研究采用高溫水浴法從海南熱帶海水中篩選得到產(chǎn)脂肪酶活性較高的地衣芽孢桿菌LD-1302。當(dāng)前，已報(bào)道的產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、芽孢桿菌B5-12、芽孢桿菌WF63、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等（胡德朋等，2008；劉秀花等，2006；黃鷺強(qiáng)等，2010；Akanbi et al.2010），其脂肪酶活依次為2.8 U/mL、24.8U/mL、6.33U/mL、2.51 U/mL，均低于菌株LD-1302的酶活。菌株LD-1302最適應(yīng)用于鹽度32、pH 8、溫度37℃的海水環(huán)境，在鹽度28～36、pH 5～9、27℃～47℃的海水條件下也存在較穩(wěn)定產(chǎn)脂肪酶活性，并可在蔗糖等速效碳源及橄欖油、椰子油和葵花籽油等有機(jī)碳源的誘導(dǎo)下產(chǎn)較高脂肪酶活，這與本研究基于海水環(huán)境下篩選產(chǎn)脂肪酶活性菌株并在該環(huán)境條件下闡述影響其產(chǎn)酶活性的主要環(huán)境因素直接相關(guān)。
有關(guān)學(xué)者篩選的產(chǎn)脂肪酶活性的菌株均是在淡水或者添加NaCl不超過10‰的環(huán)境下篩選的（李鑫玲等，2011；胡德朋等，2008；劉秀花等，2006；黃鷺強(qiáng)等，2010；Akanbi et al，2010；魏濤等，2011；陳林林等，2010；劉秀花等，2006；Eltayib et al，2010），盡管這些菌株也存在一定的產(chǎn)脂肪酶活性，但其對(duì)海水環(huán)境的適應(yīng)性尚未見報(bào)道。海水中含有Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Sr2+、Ba2+等多種離子，存在較高滲透壓，對(duì)芽孢桿菌等細(xì)菌產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性存在抑制作用（曹煜成等，2005；朱彥博等，2013），導(dǎo)致眾多在鹽度很低及不含上述離子條件下存在產(chǎn)脂肪酶活較高的菌株的產(chǎn)酶活性大大降低甚至消失。從菌株LD-1302的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹可知，雖然菌株LD-1302與Genbank中其他菌株的同源性均為99.9%，卻沒有明顯地高度聚為一支，由此我們推斷菌株LD-1302很可能為海南熱帶海洋環(huán)境中的地衣芽孢桿菌菌株，比目前常用的芽孢桿菌對(duì)熱帶海水環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。這可能是在長(zhǎng)期的歷史進(jìn)化過程中，海南獨(dú)特的熱帶沿海地理環(huán)境形成了獨(dú)特的微生物細(xì)菌地理種群。
橄欖油的主要成分為棕櫚酸C16H32O2、亞油酸C18H32O2、油酸C18H34O2、硬脂酸C18H36O2等的甘油三酯（湯富彬等，2013），菌株LD-1302產(chǎn)生的脂肪酶可將這些甘油三酯分解為C16-C18的游離高級(jí)脂肪酸，這些游離高級(jí)脂肪酸不溶于水浮于水的表面形成絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)，這是菌株LD-1302發(fā)酵24 h后在三角瓶中產(chǎn)生的浮于培養(yǎng)基表面的絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)的原因，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，這些絮凝狀乳白色蠟樣高級(jí)脂肪酸的混合物逐漸消失，推測(cè)菌株LD-1302除了產(chǎn)脂肪酶外，還可能產(chǎn)生烴類水解酶等其它酶類，將絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)分解為水溶性物質(zhì)或小分子氣體。石油是一類以C6-C20的烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴類為主的油質(zhì)，近年來(lái)，我國(guó)海面溢油與深海溢油事件時(shí)有發(fā)生，這嚴(yán)重破壞了海洋生態(tài)環(huán)境，一定程度上制約了海洋經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)健康發(fā)展（馬麗等，2013；廖國(guó)祥等，2011；楊建強(qiáng)等，2011），而微生物修復(fù)技術(shù)因高效安全、環(huán)境友好、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)，被逐漸應(yīng)用于修復(fù)溢油、深海水產(chǎn)養(yǎng)殖等造成的海洋環(huán)境污染（王麗娜等，2013；鄭天凌等，2001），所以菌株LD-1302很可能對(duì)被石油污染的熱帶海洋環(huán)境存在較好的修復(fù)作用，當(dāng)然，這還有待進(jìn)一步的深入研究。
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