產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（一）
從海南熱帶海水中分離篩選得到10株產脂肪酶菌，其中菌株LD-1302產脂肪酶活性最高。根據16S rDNA序列分析和生理生化試驗結果，鑒定該菌為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis。對該菌株的產酶條件進行優化，在pH 8、溫度37℃、鹽度32的條件下，經橄欖油誘導，起始濃度為3.75×105CFU/mL的LD-1302搖瓶發酵48 h時產脂肪酶活最高，脂肪酶活可達（34.97±1.45）U/mL。
海南管轄海洋面積200多萬km2，海洋資源豐富；不過，當前海水養殖產生的含大量殘餌、動物殘體的養殖廢水及其它來源油脂性污水的任意排放，造成了該海區海洋環境的存在脂肪污染，嚴重影響當地海洋生態環境的健康（周永燦等，2013；Nejidat，2005）。因此，安全有效清除海南熱帶水產養殖和海洋環境中的脂肪是熱帶海洋生態環境修復和可持續利用的重要前提。脂肪酶是催化長鏈脂肪酸甘油酯水解和合成的羧酸酯酶，廣泛存在于動植物和微生物，其中以微生物脂肪酶資源最為豐富；因其廣泛的底物特異性、在有機溶劑中穩定性好、易于大規模生產及純化等優點而成為當代酶工業最受矚目的酶種之一（李鑫玲等，2011；彭立鳳等，2006；閆云君等，2006），也是環境中脂肪降解的主要原動力。
海南為我國唯一的熱帶沿海地區，在長期自然進化過程中，海南地區形成了獨特的微生物群落結構，存在豐富的產脂肪酶芽孢桿菌資源，為安全解決海南熱帶水產養殖和海洋環境中脂肪污染問題奠定了重要基礎（朱彥博，2013；吳海武，2014）。不過，有關產脂肪酶芽孢桿菌的海南土著菌種的相關研究迄今尚未見報道。為此，本文試圖從海南熱帶海洋環境中篩選產脂肪酶芽孢桿菌并闡述其產酶條件，這對于應用脂肪酶生物技術處理被油脂污染的熱帶海洋水體特別是熱帶養殖水體以及可持續發展熱帶海洋經濟具有重大意義。
1材料與方法
1.1材料
樣品：從海南省樂東縣球港、陵水縣新村港、東方市板橋和三亞市南山等地的熱帶海水養殖環境中采集10份水樣。
主要試劑：蛋白胨、橄欖油（主要脂肪酸鏈長為C16-C18）、椰子油（主要脂肪酸鏈長為C8-C20）、葵花籽油（主要脂肪酸鏈長為C16-C22）、聚乙烯醇、蔗糖、4%聚乙烯醇（PVA）溶液、1 mg/mL羅丹明B溶液和橄欖油乳化液（4%PVA溶液：橄欖油=3:1，v/v）。
主要儀器：PCR儀；冷凍離心機；食品勻漿機；微生物快速立體計數儀；倒置熒光相差微分數碼顯微鏡。
1.2培養基
改良富集液體培養基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
改良羅丹明B顯色初篩培養基：（NH4）2SO42g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，瓊脂15 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min；滅菌后冷卻至60℃加入6 mL羅丹明B溶液。
改良復篩固體培養基：蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，瓊脂15 g/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
生長培養基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
計數固體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5g/L，瓊脂15g/L，滅菌海水1L，pH7.0，121℃滅菌20min。
改良產酶發酵培養基：蛋白胨10g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，橄欖油10g/L，pH7.0，滅菌海水定容至1L，pH7.0，121℃滅菌20 min。
1.3產脂肪酶菌株的篩選
吸取10mL水樣至100mL滅菌海水中，180r/min、30℃振蕩10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、靜置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液體培養基中，在180 r/min、30℃下培養。2 d后，吸取5 mL富集培養菌液至100 mL新鮮的富集液體培養基中，進行二次富集，如此連續富集培養3次。吸取1 mL第3次富集培養菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-4；吸取100μL稀釋度為10-4的菌液在羅丹明B顯色初篩培養基上涂布，挑選在羅丹明B顯色初篩培養基上水解圈較大且在350 nm紫外燈下橙黃色熒光亮斑較大的菌落為篩選分離菌株。挑取菌落繼續于羅丹明B顯色初篩培養基上重復3次劃線分離培養，直到菌落形態一致。挑取羅丹明B顯色初篩培養基上的單菌落至復篩固體培養基上重復劃線培養，直至單菌落不再染上羅丹明B顯色劑。挑選在復篩固體培養基上的單菌落至改良產酶發酵培養基中，于200 r/min、30℃下振蕩培養48 h，測定篩選得到菌株的產脂肪酶活性，以最優產脂肪酶活性的菌株為目的菌株。
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（一）
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（二）
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